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 Biologia Molecolare
 Clonaggio sequenza cDNA della B-globina
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Tag   SMAD    b-globina    vettori di espressione    cDNA  Aggiungi Tag

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Samuele Molinaro
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1 Messaggi

Inserito il - 23 maggio 2019 : 13:17:57  Mostra Profilo Invia a Samuele Molinaro un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, sto leggendo un articolo recente sulle funzioni del fattore di esporto NXF1, in pratica dicono che hanno fatto un gruppo di plasmidi SMAD reporter con differenti lunghezze al 3'UTR per vedere come si comportano quando trasferiti in cellule HeLa.La stessa cosa è stata vista per un gruppo di b-globina reporter. Per fare questi costrutti dicono questo:
''For wG and wS constructs with different 30UTR
lengths, different copies of the b-globin cDNA sequence were cloned into the 30UTR of b-globin and Smad constructs, with
1 UTR, 2 UTR and 3 UTR indicating 1, 2, or 3 copies of b-globin cDNAs.'
Potete gentilmente spiegarmi cosa hanno fatto?
Ho capito solo che SMAD è un gene reporter tipo GFP

Gigietto
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3 Messaggi

Inserito il - 23 maggio 2019 : 17:21:18  Mostra Profilo Invia a Gigietto un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
L'articolo è "The mRNA Export Receptor NXF1 Coordinates Transcriptional Dynamics, Alternative Polyadenylation, and mRNA Export", nel caso qualcuno volesse guardarlo.

La smad non è un reporter come GFP, non fluoresce. Il fatto di usare la smad piuttosto che altro non credo abbia un vero significato biologico. Tant'è che poi rifanno lo stesso esperimento con il cDNA della B-globin al posto di quello della smad probabilmente per dimostrare che l'effetto che vedono non dipende dalla sequenza del cDNA utilizzato. Quello che fanno è andare a guardare la localizzazione degli mRNA (quindi non le proteine) usando la FISH, con un probe coniugato ad un fluoroforo.

Stando alla rappresentazione grafica dei costrutti(fig.7A) e a come li hanno descritti nel testo, io credo abbiano invertito la parola cDNA con 3'UTR nei materiali e metodi. Nel testo dicono "To corroborate our global findings, we constructed a set of Smad reporter plasmids containing the same CDS with variable 3'UTR lengths"; e infatti riscrivendo la frase con le parole invertite, tutto torna: "For wG and wS constructs with different 3'UTR lengths, different copies of the b-globin cDNA 3'UTR sequence were cloned into the 3'UTR cDNA of b-globin and Smad constructs, with 1 UTR, 2 UTR and 3 UTR indicating 1, 2, or 3 copies of b-globin cDNA 3'UTR". Così ha senso e combacia con quanto scritto nel testo e indicato nello schema grafico.

Almeno a me sembra così, non ci vedo altre spiegazioni.
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