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Discussione

bt83
Nuovo Arrivato

2 Messaggi

Inserito il - 31 marzo 2009 : 23:09:30

HELP ME please!

ciao....ho un problema!
dovrei amplificare "in modo aspecifico" dei campioni di cDNA"!;
cerco di spiegarmi meglio:
devo valutare i cDNA su una card di tipo Low Density Array. Durante le prime prove ho notato che i campioni retrotrascritti da estratti di RNA con concentrazione inferiore a 50ng/ul non vengono poi amplificati durante la qPCR per tutto il pannello di sonde!
In lab uso un kit per la retrotrascrizione con random primers ma ho anche la possibilit� di usare un kit per la PreAmplificazione del cDNA anche se questo presuppone l'uso di un pool di primers specifici per la seq di cDNA del gene di interesse. E se io volessi amplificare in modo completo tutti gli espressi!Che tipo di primer posso utilizzare?
Avete consigli, dritte o anche meglio soluzioni?
GRAZIE!

miky76
Utente Junior

126 Messaggi

Inserito il - 01 aprile 2009 : 19:07:57

ciao

l'ideale sarebbe partire da una concentrazione piu elevata di RNA

50ng/ul e' un po poca

se potessi aumentarla nella RT sarebbe gia una soluzione

poi io so che Roche ha un kit per preamplificare cDNA che hanno una resa bassissima con la Quantitativa
l'idea di questo kit e' di amplificare il tuo cDNA come una PCR ma con primer universali
ti permette di amplificare tutto il tuo cDNA e non un solo gene di interesse

solo che nn mi ricordo il nome!!!
non l'ho mai usato
stavo solo parlando con un rappresentante roche l'altro giorno

quindi prova a chiamare il tuo rappresentante e a chiedere di questo kit spiegandogli il tuo problema

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 01 aprile 2009 : 20:13:33

Io so che c'era un kit della Ambion, lo avevo tempo fa in labo, se guardi sul sito trovi questo: MessageAmp� aRNA Amplification Kit, oppure cerchi aRNA e ti viene fuori un'infinit� di prodotti: http://www.ambion.com/catalog/search/results.php?keyphrase=aRNA&stl=

Comunque a quanto ne so sono tutti basati sul metodo di Eberwine:
Amplification of mRNA populations using aRNA generated from immobilized oligo(dT)-T7 primed cDNA.

che utilizza oligodT contenenti la sequenza del promotore per la T7 RNA polimerasi, lo schema � questo:

comunque sul sito Ambion trovi tutti i dettagli!

Il kit Roche non lo conosco, ma presumo che sia la stessa cosa.

Dionysos
Moderatore

Citt�: Heidelberg

1913 Messaggi

Inserito il - 01 aprile 2009 : 20:14:48

Mhm un passaggio a RNA in pi�, quindi...per gli amanti del rischio :P

Volere libera : questa � la vera dottrina della volont� e della libert�
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!

miky76
Utente Junior

126 Messaggi

Inserito il - 02 aprile 2009 : 10:39:02

ciao

non posso garantire che il kit roche sia diverso
il rappresentante, naturalmente, lo promuoveva come qualcosa di innovativo

io nn l'ho provato... perche' preferisco aumentare la concentrazione del RNA

ma basta andare credo sul sito roche e vedere

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 02 aprile 2009 : 14:52:29

Nel caso qualcuno fosse interessato, (neanche io come miky76 ho mai provato questi kit!)
su Biocompare trovate una lista di tutti (o quasi i kit disponibili)
RNA Amplification Kits

non immaginavo fossero cos� tanti!!!