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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
 Inserito il - 19 novembre 2011 : 17:19:58
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Giorno a tutti, ho un problemino da proporvi
Sto effettuando un clonaggio, per mia sfortuna il kit di eluizione da gel lavora malissimo e perdo tutto l'estratto, (l'ho riordinato) ma per ora sto cercando di fare meno passaggi possibili per arrivare alla ligation con qualche nanogrammo di vettore e di inserto. Ad esempio da 2-3 ug di materiale ne ottengo 20ng/ul......
Per i motivi di cui sopra ho evitato di defosforilare il mio vettore confidando nelle estremità non coesive, il risultato è che ho ottenuto una piastra strapiena di colonie (vettore:2800 e inserto:3900), chiaramente quindi è tutto vettore richiuso.
La mia domanda è la seguente: se digerisco il mio vettore e poi nella stessa digestione ci butto dentro la cip(senza purificare quindi), questa mi lavorerà?
Io non l'ho mai fatto in passato, ma ho letto qualche post di qualcuno che lo fa, ci sono delle accortezze da sapere? thx
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"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2011 : 21:41:39
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| Dopo digestione aggiungi la cip (controlla la compatibilità con il buffer sul sito del fornitore) e solo dopo estrai da gel. Ti consiglio di dividere il tuo plasmide + enzimi restriz in due reazioni da 2 ug di vettore ciascuna. Poi eluisci tutto insieme: partendo da 4 ug la resa sarà migliore. Cmq solo pochi ng sono necessari per la ligation (io uso 30 ng vettore e aggiungo l'inseryo in rapporto 1:5) . Una concentrazione di 20 ng/uL è nella norma |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2011 : 21:43:08
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| Ps usa la cip solo se le estremità sono compatibili |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2011 : 22:10:56
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Le estremità non sono compatibili, digerisco con SPEI e CLAI, il mio inserto è abbastanza grande (3.9kb)e l' esplosione di colonie che ho avuto in piastra può essere spiegabile solo col fatto che il vettore (2,8kb) si sia richiuso, magari perchè non è stato ben digerito.
Quindi per eliminare il background voglio fare questo passaggio.
Per la ligation servono pochi nanogrammi, in condizioni normali seguo questo "protocollo"
amplificazione da pcr,
eluizione da gel
digestione
eluizione da gel
ligation
ma se al primo passaggio di eluizione ottengo 20ng/ul(rese delle pcr generalmente alte e con 200ul di volume finale), già per la digestione diventa impossibile lavorare. Quindi mi sono ridotto a fare estrazioni in fenolo/cloroformio e precipitazione in alcol, quindi digerisco e purifico. (apsettando il kit di eluizione nuovo, che credo non arriverà mai ^^)
PS: il bianco era immacolato. |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2011 : 22:22:55
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Non avevo capito si trattasse di pcr. Puoi controllare su gel e se la banda é pulita puoi evitare l'estraz da gel.
Per quanto riguarda la digestione, con clai puoi avere dei problemi in quanto è inibito da metilazione. Attento! |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2011 : 22:42:51
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L'ho già usato in passato e non mi ha dato mai problemi, speriamo bene anche questa volta.
Comunque tornando alla questione della cip, prima di aggiungerla dovrei disattivare gli enzimi di digestione (cla+spe) oppure no?
A logica direi che non è affatto necessario. |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2011 : 22:45:24
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Infatti no. Aggiungi direttam la cip e incuba mi pare 37 gradi 10 min, controlla sul sito.
In bocca al lupo! |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2011 : 23:26:24
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Confermo quanto detto da Roberta. Aggiungi direttamente la CIP alla mix di digestione (controlla sul data sheet se è compatibile con i buffer dei restriction enzyme e controlla pure se puoi digerire contemporaneamente con i due enzimi così eviti ulteriori passaggi di purificazione). Non hai bisogno di inattivare gli enzimi di restrizione per il passaggio di defosforilazione. Puo' essere utile incubare con la CIP per un tempo un pochino + lungo (io uso la invitrogen - il data sheet indica dieci minuti se non erro a 37 per estremità 5' protruding ma io ce la tengo anche mezz'ora).
Ultimo accorgimento: ti consiglio di defosforilare anche quando le estremità non sono compatibili perchè riduce ulteriormente il background dato dal vettore non completamente digerito (digerito da un enzima solo).
In bocca al lupo |
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Digestione e CIP insieme
Didattica
