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Autore

Discussione

girlA
Nuovo Arrivato

Città: napoli

46 Messaggi

Inserito il - 09 dicembre 2011 : 12:35:55

salve ragazzi!!vorrei chiedervi un pò dichiarimenti su questa tecnica.allora:
1)devo mettere più primer nella mia provetta??o aggiungo un primer od ogni ciclo?perchè devo calcolate la tm,quindi una temperatura che li faccia funzionare tutti ma non ho capito quando li metto
2)il mg..perchè è importante??perchè se aumentano le concentrazioni diminuisce la specificità e allora sul gel di agarosio come lo vedo questo??
ho una confusione

mollichina di pane
Utente Junior

121 Messaggi

Inserito il - 09 dicembre 2011 : 13:06:25

Ciao girlA!
Di primers ne metti due Fw e Rev nella stessa provetta e calcoli la Tm per sapere a che Ta si annealano.
Cmq ti consiglio di cercare qualche vecchia discussione con la funzione, in alto a sinistra "cerca nel sito". E poi ti assicuro che nel web troverai tutto ciò di cui hai bisogno, se non hai un testo di riferimento. Puoi anche vedere dei video in cui c'è spiegato tutto.
Se poi dovessi avere ancora difficoltà, non esitare a scrivere sul forum.

Daria85
Utente

678 Messaggi

Inserito il - 09 dicembre 2011 : 13:56:08

magari sul libro di biologia molecolare riguardati un po' meglio in primis la replicazione del DNA e poi la tecnica...xkè mi pare ke tu nn te le sia ancora studiate bene.
così secondo me ti chiarirai di + ed eventualm potrai chiedere chiarim x alcuni dubbi residui

girlA
Nuovo Arrivato

Città: napoli

46 Messaggi

Inserito il - 10 dicembre 2011 : 11:46:07

ora diciamo che ho capito quancosa in più però..non riesco a capire il ruolo del magnesio..
nel senso,alte concentrazioni mi riducono la specificità in quanto il primer si va a legare anche a sequenze non del tutto complementari giusto??
ma un dubbio..ha un ruolo simile alla tm??o opposto??questo nn l' ho capito..

0barra1
Utente Senior

Città: Paris, VIIème arrondissement

3847 Messaggi

Inserito il - 10 dicembre 2011 : 12:14:39

Questo mi sembra completo

Citazione:

"Magnesium is a required cofactor for thermostable DNA polymerases. Mg2+ in the PCR mixture stabilizes dsDNA and raises the Tm. Mg2+ concentration therefore is an important for controlling the specificity of the reaction. A low Mg2+ concentration requires more stringent base pairing in the annealing step. Too few Mg2+ ions result in a low yield of PCR product; too many Mg2+ ions increase the yield of non-specific products and promote misincorporation.

Insufficient Mg2+ concentration in a PCR mixture can causes failure of the reaction. Excess magnesium (or the presence of manganese) will cause the fidelity of DNA polymerases to be reduced and may cause the generation of unwanted products. On a gel this can appear as a ladder or smear. The MgCl2 concentration should normally be between 1mM and 4mM. Since dNTPs sequester Mg2+ ions, a major change in the dNTP concentration in a rection would require a change in the concentration of MgCl2. Similarly, changing the KCl-based buffer concentration or any other component of the PCR mix may require adjustment of the Mg2+ concentration in the reaction mixture."

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss