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Autore Discussione  

gabrieleri
Nuovo Arrivato



2 Messaggi
Inserito il - 19 aprile 2013 : 13:28:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di gabrieleri Invia a gabrieleri un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Buongiorno a tutti
Cari ragazzi sono un neo ricercatore, mi sono affacciato da qualche mese in questo mondo, tutto nuovo per me.
Da 1 mese circa ho cominciato ad utilizzare la tecnica del western blot, però sin da subito ho riscontrato alcuni problemi per quanto riguarda i campioni. Per il momento sto facendo soltanto delle prove sull'actina. Dalle lastre si evidenziano alcuni campioni puliti e altri sporchi con delle doppie bande e degli aspecifici. Il grande problema è che ho i 4 campioni di sinistra puliti e i 4 campioni di destra sporchi. Ho utilizzato campioni differenti prelevati da animali differenti, ma sempre il solito problema.
DAto che non ho molta esperienza non ho proprio idea di quale potrebbe essere il problema; qualcuno di voi potrebbe darmi suggerimenti e/o indicazioni a riguardo?
Spero di essere stato il più chiaro possibile :)

Luis 22
Utente

Baricalcio

Città: Bari


755 Messaggi
Inserito il - 21 aprile 2013 : 17:48:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Luis 22  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Luis 22  Invia a Luis 22 un messaggio Yahoo! Invia a Luis 22 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Che protocollo segui?
I campioni di sinistra sono diversi da quelli di destra in che cosa? Metodiche di estrazione?


La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)&
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gabrieleri
Nuovo Arrivato



2 Messaggi
Inserito il - 22 aprile 2013 : 14:38:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di gabrieleri Invia a gabrieleri un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora i campioni provengono da 4 animali differenti e io li metto in sequenza 1 corteccia 1 cervelletto in maniera alternata.
Prelevo il campione lo inserisco in eppendorf aggiungo buffer di lisi in proporzione 3 a 1 e sonico i campioni. Dopo li quantifico con lo spettofotometro e dopodicchè preparo tutte le aliquote uguali con campioni contenenti 100 microlitri di proteine per eppendorf.
A questo punto li corro sul gel 8% 120v entrano in running 200v, poi trasferimento a 200v.
Coloro con rosso ponceau poi 3 lavaggi da 15 min per decolorare poi latte 5% over night
IL giorno dopo anticorpo primario 1h, 3 lavaggi 15 min ognuno con T-TBS, anticorpo secondario 3 lavaggi 15 min poi metto ecl e poi sviluppo.
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