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5ringsman
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
 Inserito il - 17 ottobre 2014 : 03:54:15
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Ecco il mio problema:
Evo identificare su western blot la presenza di alcune proteine fosforilate.
Ho bloccato la mia membrana con TBST 0.1%, BSA 5% per 1 ora e ho usato lo Stefano buffer per diluire gli anticorpi.
Il problema è che ottengo solo una striscia pressoché continua di bande aspecifiche.
Altri anticorpi contro proteine non fosforilate funzionano bene sulla stessa membrana.
Che devo fare? Cosa sto sbagliando!
Vi ringrazio tantissimo, ne va del mio PhD!!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2014 : 10:32:06
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Domanda stupida: hai usato inibitori delle fosfatasi nella tua estrazione?
Di solito si usano il fluoruro di sodio, NaF, ed il sodio ortovanadato, Na3VO4. |
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5ringsman
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2014 : 17:39:33
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Domanda stupida: hai usato inibitori delle fosfatasi nella tua estrazione?
Di solito si usano il fluoruro di sodio, NaF, ed il sodio ortovanadato, Na3VO4.
Si, ho usato il cocktail proto PhosphoSTOP. Ma anche fosse quello il problema, dovrei non aver nessuna banda, invece io ne ho fin troppe! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2014 : 19:19:28
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Citazione:
dovrei non aver nessuna banda, invece io ne ho fin troppe
Beh, sai, è sempre una questione di rapporto segnale/rumore. Le bande aspecifiche ci sono sempre, ma se il segnale è forte non le vedi :)
L'altra cosa ovviamente è cambiare l'anticorpo...
In ogni caso, che cosa sarebbe lo Stefano buffer???? |
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5ringsman
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
 Inserito il - 17 ottobre 2014 : 20:13:40
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 Scritto da MolecularLab Mobile
È "lo stesso buffer" col correttore automatico! ;) |
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eletav
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2014 : 11:24:38
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Prova a strippare il filtro e risaturarlo con BSA(2%)-OVA(3%)..
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Western blot proteine fosforilate
Didattica e Relazioni
