Bradford protein quantification, domanda

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prion
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Inserito il - 19 febbraio 2019 : 14:53:20

Ciao a tutti!

Sto facendo per la prima volta dei blot e non so se stia analizzando in modo corretto la concentrazione proteica dei miei campioni con Bradford assay.

Preparo la standard curve con BSA
STANDARDS STOCK VOLUME ( µL) STERILE WATER ( µL)
0 0 100
1 7.3 STOCK A 92.7
5 3.7 STOCK B 96.3
10 7.3 STOCK B 92.7
20 14.5 STOCK B 85.2
50 36.5 STOCK B 63.5
100 73 STOCK B 27

Dove lo stock A = 0.137 mg/mL, stock B = 1.37 mg/mL

Prendo i 100 uL e li metto in 1 mL di Bradford solution 1X.
Uso il primo come blank e misuro l'assorbanza delle altre soluzioni.
Con queste preparo la standard curve.

Dopodiche', prendo 2 uL del mio campione proteico, lo unisco a 98 uL di acqua e metto i 100 uL di questa soluzione in 1 mL di Bradford 1X e misuro.
Dall'assorbanza ottengo una concentrazione che divido per 2 (perche sono interessato a quanti microgrammi ci sono in un microlitro, e ne ho usati 2 dal mio sample) e cosi ho la concentrazione del campione proteico con cui devo lavorare.

Questo mi hanno spiegato di fare ma...

Quest'ultimo passaggio non mi e' chiaro, perche' io al contrario avrei moltiplicato per 50 (2 microlitri in 98 e' una diluizione 1 a 50) e non diviso per 2.

Cosa mi sfugge?
Grazie!