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biologia molecolare plasmidi ormone tiroideo cellule MDCK1

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Marcuz
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Inserito il - 05 gennaio 2023 : 20:11:33

Salve a tutti,
Sono uno studente magistrale e sto svolgendo il mio tirocinio in un laboratorio di biologia molecolare.
Sto lavorando su cellule MDCK1 (immortalizzate tumorali canine), il mio scopo � quello di vedere se avviene o meno l'ingresso dell'ormone tiroideo T3 all'interno delle cellule, in seguito a trattamenti (con relativi controlli), senza usare radioattivit� (il mio laboratorio non � attrezzato) ne fluorescenza (a quanto pare i fluorofori a causa dell'ingombro sterico non permetto il passaggio corretto dal canale). Quando sono arrivato in laboratorio stavano utilizzando un plasmide biosensore con il promotore inducibile SV40.
Nel plasmide erano presenti in questo ordine appunto SV40, Luciferasi, sequenza IRES e gene codificante per la Renilla. All'ingresso dell'ormone SV40 viene indotto a produrre l'mRNA policistronico ma ci siamo accorti che era una gran cavolata in quanto SV40 induce la trascrizione sia della luciferasi sia della Renilla (tutte e due espresse dallo stesso mRNA non mostrano differenze al saggio luminometrico).
Adesso sto procedendo a effettuare saggi solo con la Luciferasi e non ho nulla per normalizzare (in laboratorio mi dicono che dovrei con tanti campioni avere una buona normalizzazione ma la cosa mi fa un po' incavolare).
Qualche buon anima potrebbe aiutarmi a trovare un metodo per vedere sto benedetto ormone entrare (se usando un altro promotore o che ne so... altre cose) prima che io lanci qualche termociclatore fuori dalla finestra o impazzisca e mi metta a infilzare la gente con i puntali... Vi prego sono disperato.
Se mi fossi spiegato male avvisatemi che provo a spiegarmi meglio.
Grazie in anticipo.