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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
 Inserito il - 22 febbraio 2011 : 20:58:20
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Ho trasfettato un plasmide che ho usato 1000 volte (e funzionava) e non vedevo nessuna proteina. "ok, sarà successo qualcosa, si sarà degradato", quindo ho ri-preparato una maxiprep da una vecchia preparazione del plasmide, l'ho trasfettata: Tutto ok. si esprime!
Dopo una settimana ri-trasfetto il plasmide: niente! "Ok, sarà il buffer EB che è contaminato con una DNasi (!?)", ripreparo il buffer EB, ripreparo la maxi-prep da una preparazione vecchia (diversa dalla precedente, non si sa mai), la trasfetto, la proteina si esprime! Ok! Dopo una settimana, ri-trasfetto: niente, non si esprime più!!!!
AAAAAAAAAAAAaaaaaaaaaaahhh!!!!
Qualcuno ha un'idea di cosa possa essere successo?
il Plasmide è conservato a -20
P.S. E anche stasera fps online, cioccolata e testate contro il muro...
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Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2011 : 21:25:56
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| ma hai provato a correrlo su gel,qnd nn ti funziona piu? |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2011 : 21:41:33
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Strano, non è mica così facile degradare un plasmide.
Piuttosto usi sempre lo stesso reagente di transfezione? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2011 : 22:10:04
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| in effetti un problema cn la trasfezione o cn i reagenti che usi sembra piu probabile.usi mai 1 cntrollo di trasfezione?che so, gfp... |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2011 : 22:20:08
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Sempre lo stesso reagente (lipofectamina), ho un controllo di trasfezione perchè trasfetto anche altri plasmidi contemporaneamente e quelle si esprimono (anche con una buona espressione), domani provo a correre un po' di plasmide.
Vi faccio sapere... |
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2011 : 22:28:28
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Tra la prima e la seconda transfezione sicuro che non c'è nessuna differenza? A livello di reagenti, di protocollo..qualsiasi cosa.
Le cellule sono sempre le stesse?
In che modo vedi se la proteina si espressa o no?
Il controllo di transfezione in ogni caso mi sembra indispensabile perchè ti permette di capire se si tratta di un problema di transfezione o di plasmido. |
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2011 : 22:36:08
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| Abbiamo pubblicato contemporaneamente..se il controllo ci sta è un problema di plasmido, magari della funzione della proteina che stai transfettando. Che strano..se fossero batteri ti direi che a me è successo qualcosa di simile e alla fine ho scoperto che c'èra una variabilitá tra le colonie che analizzavo, cioè che in alcune si esprimeva e in altre no...e per questo mi sembrava che a volte si esprimeva e altre no, ma in questo caso mi sa che non ha molto senso. |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 01 marzo 2011 : 21:42:13
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Ho corso il plasmide digerito con un Enzima di restrizione (per vedere la forma linea) e l'altezza di corsa è quella giusta, non ci sono degradazioni. Ho fatto uno spettro da 240 a 300 nm del plasmide e mi appare un picco di assorbanza a 258, non sono presenti altri picchi.
Altre idee? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 01 marzo 2011 : 21:52:44
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| avrei detto reagenti o cellule,ma se i controlli di trasfezione ti vengono... Come determini se la proteina è espressa? |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2011 : 01:51:11
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Potrebbe benissimo essere la variabilità biologica dell'esperimento.
Potresti non essere sempre nelle migliori condizioni
di efficienza di gene transfer perchè la tua proteina
venga espressa in maniera detectabile.
Otherwise: variabilità tecnica nel tuo western, ovvero
non diamo per scontato che la proteina possa esserci
ma che magari - a volte- il western non ti venga.
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2011 : 01:54:14
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In pratica i tuoi controlli positivi di transfezione
potrebbero essere "troppo positivi" 
E' una signorina difficile, questa proteina? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2011 : 10:13:27
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lol, una signorina difficile
Sono d'accordo con Dionysos sul fatto che l'esito wb nn deve essere dato per scontato. PARALLELAMENTE al wb, potresti guardare se il gene in questione è espresso a partire dal suo mRNA. La cosa pero' si complicherebbe se il gene fosse espresso anche a livello endogeno: nel caso il tuo costrutto fosse taggato potresti fare una RT-PCR (reverse transcriptase) e disegnare un primer nel tag e uno nella sequenza codificante di detto gene.
Domanduccia: hai parlato di maxi prep...Il tuo sistema è endotoxin free?(anche se mi aspetterei una citotossicità generale sulle tue cellule piu' che un blocco trascrizione/traduzione) |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2011 : 11:21:53
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io e la signorina ci conosciamo da anni, e si esprime abbastanza bene! Nell'esposizione da 5 minuti si vede proprio bene (una bella bandazza ). Mi pare strano passare da 100 a 0...in 1 settimana! Le altre proteine non sapevo come si esprimessero, quindi la mia mi serviva anche come controllo. Ed è successo esattamente l'opposto!
Provo a scongelare altre cellule...non si sa mai. Il gene è taggato, quindi posso provare a fare la RT.
Per i WB ora me li ri-guardo e vedo se noto qualcosa di curioso...Grazie per i consigli! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2011 : 11:34:43
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Beh, lo sai che in western dire "5 minuti" è come non dire niente : il tempo che ci mette a saltar
fuori dipende da quanto carichi, , da quanto è fresca la diluizione del tuo anticorpo, da quanto è
fresco il lisato, dal tipo di reazione che usi, da quanto è recente la reazione (se è ECL), e da un
sacco di altre cose con in ultima istanza l'abbondanza assoluta della proteina.
Il western - purtroppo - ti dà un'idea quantitativa solo quando
paragoni una banda ad un'altra nello stesso gel rispetto ad un
normalizzatore interno. Se hai fatto così allora sì, puoi dire
"si esprime bene/si esprime dimmerd/ecc..
Puoi comunque uscirne: se hai dei controlli positivi appropriati
interni al western (ovvero: la stessa proteina, magari endogena, in
altri campioni) allora puoi escludere il problema tecnico del WB e
iniziare a pensare che sia una magagna di tipo biologico.
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Plasmide non si esprime più...
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