amplificazione cDNA tramite RT PCR

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Discussione

pasqualep.
Nuovo Arrivato

Prov.: NA
Citt�: C/MARE DI STABIA

12 Messaggi

Inserito il - 19 gennaio 2012 : 11:26:35

Ciao a tutti

vorrei chiedere dei chiarimenti riguardo la RT PCR (non la real time, ma la retrotrascription pcr). Gli enzimi che utilizzo per una RT PCR sono una retrotrascrittasi e una DNA polimerasi... tuttavia non mi � chiaro in un normale esperimento, (non ho mai fatto RT PCR ma solo PCR) se la retrotrascrizione avviene in vitro oppure la si fa avvenire nel termociclatore... e in ogni caso chi mi sintetizza il 2� filamento a DNA in questo caso?
Quello che io penso, ma voi correggetemi, � che prima mi creo il cDNA con la RT e i metodi per il 2� filamento e poi con primer specifici me lo amplifico. Tuttavia ho letto che in certi casi si fa avvenire direttamente tutto in vitro facendo una fase di retrotrascrizione ed una di amplificazione in cicli successivi. In tal caso ancora il dubbio che mi viene � come si crea il secondo filamento? L'rna non influenza negativamente se � ancora ibridato al DNA? E infine, � vero che esistono anche enzimi con doppia attivit� sia retrotrascrivente che di dna polimerasi??

DA QUI

A QUI

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 19 gennaio 2012 : 18:33:03

Sono un po' di fretta, comunque se cerchi sul forum se ne � parlato diverse volte!

In due parole:
- la fase di retrotrascrizione con la retrotrascrittasi ti permette di sintetizzare il filamento complementare all'RNA, quindi ottieni un cDNA ibrido DNA/RNA
- a questo punto le opzioni sono due:
1) degradare il filamento di RNA (molte retrotrascrittasi anche anche l'attivit� RNAsica) e ti rimane in cDNA a singolo filamento
2) utilizzare il cDNA cos� com'� nella PCR
- nel primo ciclo di amplificazione con la DNA polimerasi si forma il secondo filamento di cDNA (quello corrispondente all'RNA)
poi negli altri cicli hai l'amplificazione.