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marco86
Nuovo Arrivato
Prov.: Novara
6 Messaggi |
 Inserito il - 29 maggio 2008 : 12:01:48
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Ho bisogno di un grandissimo aiuto.
Disegnare dei primers senza l'ausilio di software.
Per esempio data una sequenza di x bp, la devo amplificare ed il prodotto di pcr deve essere sotoclonato in un vettore con siti di restrizione.
Se ci sono degli esempi pratici per capire.
Grazie
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mark86 |
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GisGis
Nuovo Arrivato
Prov.: TP
Città: Marsala
9 Messaggi |
Inserito il - 29 maggio 2008 : 13:01:35
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Ma perchè nn devi usare software?
...intanto io cerco di studiare il tuo caso...
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marco86
Nuovo Arrivato
Prov.: Novara
6 Messaggi |
Inserito il - 29 maggio 2008 : 17:05:33
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Non posso usare il computer, in quanto sarà un compito d'esame
Ho lasciato anche un altro mex su questo forum, li c'è proprio un probabile testo d'esame. Grazie x l'aiuto |
mark86 |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 29 maggio 2008 : 19:24:45
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Mmm...e dov'è il problema???
Io i primer li so disegnare solo a mano!!!
Se la tua sequenza è:
5'-ACTGCTAGCTACGGCATCATGACTCAGATCGACTCAGACTACGACATCTACGACGGCTATCGACGACTACG-3'
3'-TGACGATCGATGCCGTAGA... GCCGATAGCTGCTGATGC-5'
Il primer Fw sarà:
5'-TGACGATCGATGCC-3'
ci puoi aggiungere il sito Bam ad esempio GGATCC, e diventa:
5'-GGATCCTGACGATCGATGCC-3'
Un po' più di attenzione devi porre al reverse, poichè devi praticamente leggere la sequenza del filamento di sotto al contrario (5'->3')
quindi:
5'-CGTAGTCGTCGATAGCCG-3'
e alla stessa maniera puoi aggiungere un sito di restrizione, ad esempio EcoRI GAATTC, ed esce:
5'-GAATTCCGTAGTCGTCGATAGCCG-3'
Sono stato chiaro? è difficile?
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Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 29 maggio 2008 : 19:51:50
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Citazione:
Messaggio inserito da domi84
Mmm...e dov'è il problema???
Io i primer li so disegnare solo a mano!!!
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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GisGis
Nuovo Arrivato
Prov.: TP
Città: Marsala
9 Messaggi |
Inserito il - 29 maggio 2008 : 20:14:02
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ma tu la sequenza la sai, allora?
perchè sei hai la sequenza il problema è semplicissimo, come già ti è stato mostrato
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Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 29 maggio 2008 : 22:10:00
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impara bene a scriverli a mano perchè se finisci in un lab come quello in cui ero io qualche tempo fa ogni cosa deve essere fatta a mano, quindi primer per PCR, per sequenziamento e pure il sequenziamento prima e dopo il clonaggio andava controllato a voce, era davvero patetico! ore a dare le lettere!!!!!   |
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marco86
Nuovo Arrivato
Prov.: Novara
6 Messaggi |
Inserito il - 30 maggio 2008 : 17:12:23
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| Un tipo di esercizio l'ho pubblicato in un altra discussione |
mark86 |
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là
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 30 maggio 2008 : 17:14:04
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| ciao! anche io li faccio sempre a mano e faccio come ti ha spiegato chiaramente domi |
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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
280 Messaggi |
Inserito il - 30 maggio 2008 : 18:07:22
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Penso che quasi tutti li facciano a mano e poi i più tecnologici li controllano con i software. A volte mi capita però di farli con i software e poi mi scelgo quello che mi piace di più (e che mi serve d+ !).
I software sono molto utili ma se non si capisce quello che c'è sotto sono inutili!!! |
Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala. |
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
Inserito il - 30 maggio 2008 : 18:30:22
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Un buon Primer deve avere un'alta specificità , ciò significa:
-Alto contenuto in GC 70-80%
-Lunghezza media dai 18-25 bp
-Non fare Primer Dimer
-Non fare hairping formation
-Avere una specificità unica nel templato
Queste sono le linee base per un buon primer, più è lungo il primer e piu¹ c'è¨ la probabilità di hairping formation.
Oligo è un buon programma, sia per simulazioni di PCR, ma anche per la costruzione dei primer.
Per PCR: Le temperature di melting di annealing vanno teoricamente aggiustate a seconda del primer
Del resto i primer servono da innesco di replicazione, perciò lo puoi costruire a seconda delle esigenze..
Ciao! |
www.tlbspazio.it
Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi |
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Rsr
Nuovo Arrivato
Città: Modena
15 Messaggi |
Inserito il - 04 giugno 2011 : 23:02:22
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Scusa Domi84 ma penso proprio che hai disegnato i primer in maniera sbagliata.
Innanzitutto le estremità 3' del primer fw e di quello rv devono "guardarsi" in modo che i due terminali delimitino il segmento di DNA da amplificare.
Il primer fw si disegna in maniera COMPLEMENTARE all'elica senso, il reverse a quella antisenso.
Stando alla tua sequenza, il primer fw è:
5'-ACTGCTAGCTACGG-3'
Quello revere:
5'-CGTAGTCGTCGC...-3'.
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Discussione |
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Disegnare primer per PCR a mano
Didattica
