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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
 Inserito il - 06 giugno 2011 : 20:53:28
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Ciao a tutti, ecco il mio problema:
ho clonato un frammento in pGEM-T easy vector, ne ho verificato il corretto inserimento tramite colony pcr e digestione enzimatica, oltre ad aver sequenziato il frammento stesso all'interno del vettore. Fin qui tutto ok.
Mi sono pero' accorta che, digerendo il mio plasmide con un enzima che dovrebbe darmi una sola banda (di circa 4000 bp, più una piccola banda non visibile di 16 bp), ne ottengo invece 2, una di circa 3000 e un'altra di circa 1000 bp, esattamente come se il plasmide fosse lineare. Mi chiedo se sia realisticamente possibile che il plasmide sia lineare... Apprezzerei tantissimo se qualcuno con esperienza in clonaggio mi desse un parere, sto impazzendo perchè devo procedere con un subclonaggio...
Grazie!
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2011 : 21:10:30
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| non è lineare. e' molto piu' realistico pensare che il tuo enzima taglia in due o piu' punti, tanto piu' che mi dici che normalmente darebbe una banda di 4000 bp piu' una di 16... |
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thejoint84
Nuovo Arrivato
46 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 giugno 2011 : 23:23:40
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| Concordo con i commenti precedenti, comunque potresti seminare su gel anche il plasmide non digerito! Vedrai che non sarà lineare! |
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jovy
Nuovo Arrivato
102 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2011 : 12:21:53
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è normale che dopo taglio con enzimaq di restrizione tu debba ottenere il plasmide linearizzato...
La cosa che mi viene da pensare è che magari proprio nell'inserto che hai clonato ci sia una sequenza di riconoscimento per l'enzima di restrizione che hai usato...e così hai ottenuto due bande...che infatti sommate danno la grandezza che ti aspettavi... |
gi |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2011 : 14:57:27
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grazie a tutti, ho trovato la soluzione: semplicemente l'inserto è legato a pGEM-T con orientamento opposto a quello che avevo previsto con una simulazione, per cui il pattern di restrizione andava aggiornato secondo la reale mappa del plasmide finale!
Grazie |
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Plasmide lineare dopo miniprep????
Didattica
