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cece23
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
 Inserito il - 15 settembre 2011 : 15:21:22
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Ciao a tutti
Ho una domanda da porvi. Ho trasformato una pianta usando la tecnica dell'agrobatterio. So per certo dove il T-DNA si è inserito nel genoma. Ora devo analizzare il numero di copie di T-DNA inserito e se ci sono stati riarrangiamenti. Premetto che non posso fare una PCR perchè il mio T-DNA presenta una struttura particolare che impedisce lo svolgimento di una normale pcr. Ho pensato pertanto di digerire tutto il mio DNA genomico con AvrII, infatti a monte e a valle del T-DNA (nel cromosoma) ci sono due siti AvrII. Ovviamente otterrei milioni di frammenti e quindi sul gel vedrei solo un lungo smear.
Io ho due certezze però:
-Il mio T-DNA è molto lungo > 20Kbp e
-a monte e a valle del T-DNA ci sono due siti HpaI (interni però rispetto a AVrII).
Ho pensato perciò che se digerisco con HpaI riduco enormemente il numero di frammenti > 20Kb (è come se fosse una nested, ma con gli enzimi di restrizione). Quindi vorrei fare una seconda digestione con HpaI del primo prodotto di digestione (AvrII) ma non so se è possibile. Cioè se io ho 20 ul derivanti dalla prima digestione posso trattarli direttamente per una seconda digestione?
In alternativa dovrei forse fare correre un gel, prelevare una fetta all'altezza >20 kb, purificarla e poi digerirla con HpaI.
QUalcuno può darmi un consiglio? Se avete anche altre idee accetto volentieri consigli
Grazie
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 15 settembre 2011 : 15:49:00
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| e se facessi un southern blot? |
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cece23
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 15 settembre 2011 : 15:52:35
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Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
e se facessi un southern blot?
Già fatto, così come la Real-Time. Il risultato delle analisi però è contrastante. Questo è il motivo per cui devo fare la digestione |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 15 settembre 2011 : 16:39:12
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| In teoria si potrebbe fare, penso sia una buona idea ma non ho capito se questi siti HpaI sono esterni al T-DNA oppure interni, perchè se son interni nn ti serve a nulla |
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cece23
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 15 settembre 2011 : 17:15:57
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Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
In teoria si potrebbe fare, penso sia una buona idea ma non ho capito se questi siti HpaI sono esterni al T-DNA oppure interni, perchè se son interni nn ti serve a nulla
sono esterni al T-DNA, ma interni rispetto a AvrII.
Ok allora, proverò a digerire direttamente in provetta.
Grazie |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 15 settembre 2011 : 17:57:18
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| Beh, prima assicurati che i buffer di digestione siano compatibili, altrimenti dovrai prima purificare il DNA |
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digestione di un prodotto già digeriro
Didattica
