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adham
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
 Inserito il - 01 novembre 2011 : 14:47:37
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Salve a tutti ho dei problemi a capire come fare un fill-in
ho digerito il mio plasmide con claI(5') e smaI(3'), per togliere via una banda, quindi ho estratto il plasmide da gel e ora dovrei fare il fill-in per colmare l estremità stiky di claI e poi richiuderlo con la ligasi.
quale enzima dovrei usare, ho visto che c è differenza tra la klenow e la t4 DNA polimerasi
questo è il mio sito di taglio di claI
5'..AT/CGAT...3'
3'..TAGC/TA...5'
QUINDI a me servirebbe qualcosa che lavorasse in direzione 5'-3' aggiungendo una C e una G. Io userei la t4, ma non son sicuro se va bene.
Seconda domanda, se appena fatta la reazione del fill-in, procedo subito con la ligation senza inattivare con la temperatura la t4, secondo voi è sbagliato?
Scusate le domande, ma è la prima volta
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2011 : 15:03:07
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la differenza tra klenow e T4 è che la attività esonucleasica 3'->5' è molto piu' efficiente nella t4 che nella klenow. Se quindi dovessi rimuovere nucleotidi per ottenere blunt ends, ti suggerirei di usare la t4. Ma qui si tratta di fill in, quindi entrambe vanno bene. Io ho sempre usato la t4, perchè in lab compriamo praticamente solo quella.
Per quanto riguarda la seconda domanda, beh per esperienza personale io preferisco sempre inattivare/purificare prima di passare a uno step successivo; tra l'altro non so se il buffer della t4/klenow è compatibile con quello della ligasi. |
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adham
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2011 : 15:19:52
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grazie spemann!!
Il problema è che ho poco materiale di partenza, all'incirca 400ng di plasmide su cui fare il fill-in,se poi eluissi rimarebbe poco o nulla per la ligation. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2011 : 16:11:39
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| beh allora inattiva col calore, e successivamente aggiungi la ligasi (se non erro in effetti si può aggiungere la ligasi nel buffer di reazione della t4 polymerase, ad ogni modo controlla sul data sheet). |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2011 : 17:19:46
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io quando faccio Kunkel mutagenesis uso t4, e poi aggiungo direttamente nell reazione la ligasi senza inattivare ne' niente...
certo una botta di calore come suggerisce Spemann non e' male come idea. |
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problemi col fill in
Didattica
