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Alberto90
Nuovo Arrivato



23 Messaggi
Inserito il - 17 dicembre 2011 : 12:24:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Alberto90 Invia a Alberto90 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il professore ci ha dato un compito da svolgere. Quali strumenti posso usare per rispondere a queste domande? E' possibile sapere la taglia dell'amplificato senza sapere il gene di partenza???

1) A che scopo possono essere utilizzati i primer di PCR seguenti?

TGCTGTGAATCCCAGAGAACTGATG
GGCGGGGCTTTATCATCTCCA

2) Quali sono le temperature di melting di questi primer?
Quale temperatura di annealing posso impostare?

3) Quale sarebbe la taglia dell'amplificato prodotto?

4) Quale sarebbe la composizione nucleotidica dell'amplificato prodotto?

roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi
Inserito il - 17 dicembre 2011 : 15:49:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Un po' difficile rispondere senza sapere su quale organismo vuoi fare la PCR. Se tu avessi questa informazione, potresti fare un blast dei tuoi primer per sapere a che regione si appaiano e allora ricavarti la lunghezza dell'amplicone che ne deriva.
Di solito si cerca di disegnare primer con la stessa lunghezza (20 nt all'ottimo) e con la stessa %GC (da cui dipende appunto la temperatura di melting). Per primer con lunghezza <20 nt, Tm = 2(A+T)+4(G+C). Se i primer sono più lunghi, ti consiglio di utilizzare un software (ad es. OligoCalc). Una volta determinata la Tm dei 2 primer (nel tuo caso i primer avranno Tm diversa l'uno dall'altro), usa una temperatura di annealing di 2-4 gradi inferiore alla Tm del primer con Tm più bassa.
Personale considerazione:
- Il primer n°1 è lungo 25 nt e ha una %GC=48;il primer n°2 21 nt ed ha %GC=57%----> io sceglierei primer con lunghezza e %GC simili, e se possibile uguali.
- Si dovrebbe evitare di far cominciare un primer con una A o una T, essendo il legame AT meno forte di quello GC.
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Alberto90
Nuovo Arrivato



23 Messaggi
Inserito il - 19 dicembre 2011 : 15:37:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Alberto90 Invia a Alberto90 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Infatti, ma il professore l'esercizio cel'ha dato esattamente così!

Quindi ho ragionato trovandomi la sequenza 5'->3' che è riconosciuta da questi 2 primer poi ho usato un programma di allineamento trovando un alta corrispondenza per questo gene

lcl|NM_001253443.1_cdsid_NP_001240372.1 [gene=ORNANAV1R3051] [protein=vomeronasal 1 receptor ornAnaV1R3051 precursor] [protein_id=NP_001240372.1] [location=1..1137]

Di cui il forward riconosce 25/25 basi (da 21 a 45) e del reverse ne riconosce 20/21 nella zona (311-321). Il problema è che questo gene presenta solo la CDS quindi non ha molto senso amplificare la zona interna ai due primer (46-310) ma mi sembra l'unica soluzione plausibile da dare come risposta visto i dati che ci propone.
E' sbagliato un ragionamento simile?

Per la temperatura di Melting ho usato un prgramma simile a quello che mi hai consigliato!

Grazie della risposta!
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