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cry87
Utente Junior
Città: milano
127 Messaggi |
 Inserito il - 23 febbraio 2012 : 14:05:10
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Ciao, mi potreste spiegare i dosaggi enzimatici con deidrogenasi NADPH dipendenti? Quale è il ruolo del NADPH?
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
 Inserito il - 23 febbraio 2012 : 14:12:27
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No, è già tutto nel forum ed è stato spiegato a più riprese nel corso degli anni da svariati competenti fruitori di questo spazio.
Puoi incominciare con una ricerca sul forum, tenendo presente che concettualmente i dosaggi che sfruttano il NADPH sono identici a quelli che ricorrono al NADH. E altrettanto vale per le loro forme ossidate.
Persistessero dubbi, ma son sicuro che i messaggi son scritti cosi' professionalmente che afferrerai tutto, allora sentiti libera/o di fare tutte le domande che vuoi. Ma prima leggi. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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cry87
Utente Junior
Città: milano
127 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2012 : 14:14:11
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| Simpatia porta via. Ok cerco, grazie. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2012 : 14:36:16
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Prego  |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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cry87
Utente Junior
Città: milano
127 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2012 : 19:50:29
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Ho passato tutto il giorno a leggermi le altre discussioni sui dosaggi ma continuo a non capire che relazione c'è tra la concentrazione del prodotto e il NADH ad es. nel dosaggio del glucosio! Sarò stupida, è probabilissimo
Io so che devo accoppiare queste due reazioni perchè la prima reazione non potrebbe essere dosata perchè sia i substrati che i prodotti hanno gli stessi spettri di assorbimento.
Glucosio + ATP -----> Glucosio 6P + ADP –esocinasi-
Glucosio 6P + NADP+ ----> 6Fosfogluconato + NADPH –glucosio6PDH-
Si valuta in questo caso la comparsa di NADPH che è proporzionale alla concentrazione di G6P che viene via via prodotto dall'esocinasi. Io non capisco perchè!!
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cry87
Utente Junior
Città: milano
127 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2012 : 19:53:32
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Calcolo il n° di unità di enzima presente nel campione con questa formula:
U/l = (deltaA * 1000 * V)/ (epsilon * t * d * v)
ma in questa formula devo inserire l'assorbanza del NADH? |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2012 : 21:16:38
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Citazione:
Messaggio inserito da cry87
Si valuta in questo caso la comparsa di NADPH che è proporzionale alla concentrazione di G6P che viene via via prodotto dall'esocinasi. Io non capisco perchè!!
Come puoi notare, puoi trovare un coefficiente stechiometrico che leghi NADPH e glucosio.
Se sommi le due reazioni puoi scrivere:
glucosio + ATP + NADP+ ----> 6 fosfogluconato + NADPH + ADP
Ciò significa che PER OGNI glucosio che viene trasformato in un 6 fosfogluconato, UN NADP+ è ridotto a NADPH.
Quindi, se riesci a misurare la variazione di assorbanza di NADPH, grazie alla Legge di Lambert-Beer potrai anche conoscere di quante moli (o più probabilmente micromoli) è variato NADPH (che si è formato). Ora, in tale maniera, poiché abbiamo detto 1 glucosio = 1 NADPH, sai anche quanto glucosio è stato consumato.
Poiché la reazione avviene in presenza di reagenti in eccesso (eccedenza di NADP+ e ATP) praticamente tutto il glucosio è convertito in prodotto, perciò misuri quanto glucosio avevi inizialmente nel campione.
Ti faccio notare che nella spiegazione fornita c'è anche l'indicazione di quale assorbanza tu debba inserire nella formula da te riportata |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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cry87
Utente Junior
Città: milano
127 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2012 : 21:22:51
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l'assorbanza che devo inserire è l'assorbanza del campione - l'assorbanza del bianco.
Ma se la prof mi chiede di spiegare passo passo il dosaggio del glucosio, posso scrivere così?
1) metti la stessa quantità, ad es. 1 mmol, di substrato in 10 provette
2) aggiungi quantità note di enzima alle provette (es. 0.1 U nella prima provetta, 0.2 nella seconda, 0.5 nella terza, poi 1, 2, 5, 10 etc.)
3) aspetti il tempo necessario perchè la reazione avvenga (eventualmente dovrai aggiungere qualche reagente o cambiare la temperatura a seconda dell'enzima)
4) misuri con uno spettrofotometro l'assorbanza dei vari campioni ad una opportuna lunghezza d'onda
5) fai una retta di taratura con i punti ottenuti, quindi metti in grafico l'assorbanza vs. le unità enzimatiche
6) finalmente puoi fare il tuo saggio: prendi 1 mmol di enzima (o quanto ne avevi messo nello standard) e aggiungi il tuo campione contenente x unità di enzima. Poi vai a leggere l'assorbanza e vedi dove si trova sulla retta di taratura e puoi estrapolare la quantità di enzima nel tuo campione!
Questa non la spiegazione di un dosaggio discontinuo? Che tipo di dosaggio è quello del glucosio? Oddio.
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2012 : 21:32:20
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| Tu parli di dosare il glucosio, poi però mi racconti come dosi un enzima.. |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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cry87
Utente Junior
Città: milano
127 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2012 : 21:38:43
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Ah, in effetti.
E quindi se dovessi scrivere passo passo come doso il glucosio cosa dico? Scrivo così?
Glucosio + ATP -----> Glucosio 6P + ADP
non potrebbe essere dosata perchè sia i substrati che i prodotti hanno gli stessi spettri di assorbimento
Per questo si accoppia la reazione della G6PD:
Glucosio + ATP -----> Glucosio 6P + ADP –esocinasi-
Glucosio 6P + NADP+ ----> 6Fosfogluconato + NADPH –glucosio6PDH-
Si valuta in questo caso la comparsa di NADPH che è proporzionale alla concentrazione di G6P che viene via via prodotto dall'esocinasi.
Poi quello che mi hai scritto tu
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2012 : 23:35:13
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Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
Tu parli di dosare il glucosio, poi però mi racconti come dosi un enzima..
Come ti faceva notrare 0/1, un noto arrogante flammer e frequantatore di social network, il dosaggio di un enzima e il dosaggio di un analità sono due cose diverse. Nel primo caso si calcola l'attività enzimatica espressa come unità enzimatiche. Il secondo caso è invece un saggio endpoint dove grazie ad una retta di taratura si misura la quantità di analità resente (per il glucosio mg/dL). Questa è la formula che si utilizza in questo caso
Immagine:
20,08 KB
Il calibrator è una soluszione a titolo noto di glucosio |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 24 febbraio 2012 : 00:26:00
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Citazione:
Messaggio inserito da Martin.diagnostica
Come ti faceva notrare 0/1, un noto arrogante flammer e frequantatore di social network,
Sento proprio la tua mancanza quando diserti il forum
Esochinasi, non cinasi.
Circa quello che hai scritto tu alle 21.22.51, per costruire la curva di taratura userai concentrazioni decrescenti di glucosio e manterrai costante le U/l degli enzimi. |
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cry87
Utente Junior
Città: milano
127 Messaggi |
Inserito il - 27 febbraio 2012 : 19:18:05
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Nel caso di un dosaggio con la Glutammico deidrogenasi come devo procedere?
Io so che catalizza questa reazione:
2-ossoglutarato + ammoniaca + NADPH + H+ ---> L-glu + NADP+
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 04 marzo 2012 : 06:33:12
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| Prova a proporre tu una soluzione, una volta che hai capito un caso specifico hai il setup delle varie varianti... |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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