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vaneve
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45 Messaggi |
 Inserito il - 16 maggio 2012 : 12:09:23
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Ciao a tutti!
Sto impazzendo da vari mesi con un clonaggio perché ogni volta ne succede una diversa. L'ultima è stata questa: dopo la trasformazione, presenza di colonie: zero!!!
Anche utilizzando un vettore supercoiled: zero!!!
Ieri, prima di cercare un altro elettroporatore, ho provato a cambiare cuvette. Invece di usare quelle con distanza inter-elettrodo 1mm, ho usato quelle da 2 mm. oggi è successo il miracolo: le colonie ci sono e sono anche tante!!!
Ora mi chiedo, ma è possibile che sia solo colpa delle maledette cuvette? E se così fosse, in che modo?
Nel senso, forse le cuvette da 1mm non andavano bene per la mia trasformazione (ho usato cone cellule competenti XLblue e ho anche fatto una prova con SURE)?
Oppure dopo un po' di tempo le cuvette non conducono più la corrente in modo appropriato?
Se qualcuno mi sa illuminare, lo ringrazio infinitamente!
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valestellina
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2012 : 12:39:36
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Il problema dell'uso delle cuvette di solito è duplice:
- La distanza fra le piastre/elettrodi della cuvetta è importante in base di solito a cosa trasformi: ad esempio si usano cuvette a distanze diverse per lieviti e per E. coli, anche se oggi esistono molte ditte con delle distanze "universali" che vanno bene per tutto
- Il voltaggio e la lunghezza dell'impulso purtroppo alle volte fanno una enorme differenza sul risultato finale (resa di colonie)
Se la cuvetta non va più bene di solito te ne accorgi durante l'impulso: senti come un piccolo scoppiettio che indica che si è bruciata. In quel caso la butti e la cambi. Ovviamente se curi adeguatamente lo stato di pulizia delle cuvette e se le tieni in ghiaccio prima di usarle ne prolunghi la vita media, ma non sono eterne.
Una domanda magari banale: i due esperimenti con le due cuvete (1 mm e 2 mm) lo hai fatto trasformando con la stessa reazione di ligazione oppure no? Perchè sai, può essere semplicemente che questa volta hai avuto un risultato perchè la ligazione è avvenuta con successo, mentre l'altra volta no... |
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