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Discussione |
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viola83
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: bologna
12 Messaggi |
 Inserito il - 01 aprile 2008 : 14:33:24
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E' indispensabile utillizare una DNasi per eliminare il DNA genomico dopo l'estrazione dell'RNA o c'è qualche metodo per controllare la "purezza" di quello che ho estratto saltando questa fase?
Mi hanno detto che può essere utile far correre l'RNA estratto su un gel agar 1% e vedere se le bande che ho sono quelle dell'RNA ribosomiale, è vero? Durante la corsa devo usare un Loading per l'RNA specifico?
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LUCIA14976
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 01 aprile 2008 : 17:07:59
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anche utilizzando la DNase non riesci ad eliminare del tutto il DNA genomico. Quindi può anche essere che puoi evitare di fare la digestione con la DNase, infatti dipende da quello che devi fare. per esempio se devi usare l'RNA per fare cDNA da saggiare in real-time dipende da quanto il tuo gene di interesse è espresso. infatti la contaminazione genomica può essere così bassa da non interferire con la valutazione del tuo gene.
comunque per vedere se la tua estrazione di RNA è contaminata da genomico basta semplicemente che fai una PCR utilizzando come templato l'RNA così amplificherai solo l'eventuale DNA. Stai attenta al numero di cicli da utilizzare. infatti se arrivi a saturazione con la PCR non riuscirai a valutare l'entità della contaminazione.
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Topogigio77
Nuovo Arrivato
Città: Milano
37 Messaggi |
Inserito il - 01 aprile 2008 : 17:24:16
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| mmhhh... mi trovi in disaccordo... infatti se usi l'RNA per fare cDNA e quindi fare studi di espressione genica, molto dipende da dove piazzi primers (SYBR) o primers e sonda (TaqMan), infatti se sono piazzati a cavallo di giunzioni esoniche concordo con te che puoi eviatare il trattamento con DNase (anche se cascasse il mondo io lo faccio sempre, con la Turbo DNase che rimuove completamente il genomico, una bomba), in caso contrario stai ben carta che ti tiri dietro segnali aspecifici del genomico, piccoli o grandi che siano...e lo studio di Gene Expression va a farsi benedire.. |
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LUCIA14976
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 01 aprile 2008 : 17:55:05
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quello che dice topogigio77 è vero in generale. ma ogni caso deve essere valutato separatamente. non ho ancora capito per quale applicazione serve l'RNA di viola83 quindi ho fatto l'esempio della real-time proprio perchè a seconda del metodo di purificazione che uno usa e asseconda di quanto è espresso il gene di interesse uno può anche fregarsene della contaminazione da DNA genomico. se il tuo gene è espresso in un ordine di grandezza che è 5 ordini di grandezza superiore a quello della contaminazione genomica, direi che in questo caso diventa assolutamente irrelevante.
prima di iniziare qualsiasi tipo di esperimento con l'RNA si deve capire che grado di degradazione e che grado di contaminazione genomica si rischia di portarsi dietro con il metodo di estrazione scelto e poi si fanno delle scelte.
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viola83
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: bologna
12 Messaggi |
Inserito il - 02 aprile 2008 : 09:55:59
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| L'RNA mi serve proprio per valutare l'espressione genica di una proteina; quindi devo convertirlo a cDNA e poi faccio una semplice PCR |
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viola83
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: bologna
12 Messaggi |
Inserito il - 02 aprile 2008 : 15:42:20
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| quindi pensate che l'elettroforesi che mi hanno suggerito non mi dia una valutazione reale di quello che ho estratto? |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 02 aprile 2008 : 16:19:14
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| Anche un Agilent (Bioanalyzer) può aiutarti |
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max2612
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2008 : 12:56:05
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ciao dato che devi retrotrascriviere a cDNA c'è un metodo semplice per verificare se sono presenti contaminazioni da genomico e farne una valutazione.
sottoponi un campione dei prodotti della retrotrascrizione ad un PCR qualitativa con primer disegnati su una parte di gene, in cui due zone esoniche fiancheggiano un'introne. i primers disegnati sulle due zone esoniche permettono di discriminare attraverso diversi pm eventuali contaminazioni da genomico, infatti sono attese 2 bande di diverso pm:
- 1 più alto corrispondente alle dimensioni delle zone esoniche e della zona intronica
- 1 più basso corrispondente alle dimensioni delle sole zone esoniche
utilizando diluizione seriali dei campioni da valutare puoi stimare il grado di contaminazione.
ciao ciao
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 21:52:32
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Citazione:
Messaggio inserito da max2612
ciao dato che devi retrotrascriviere a cDNA c'è un metodo semplice per verificare se sono presenti contaminazioni da genomico e farne una valutazione.
sottoponi un campione dei prodotti della retrotrascrizione ad un PCR qualitativa con primer disegnati su una parte di gene, in cui due zone esoniche fiancheggiano un'introne. i primers disegnati sulle due zone esoniche permettono di discriminare attraverso diversi pm eventuali contaminazioni da genomico, infatti sono attese 2 bande di diverso pm:
- 1 più alto corrispondente alle dimensioni delle zone esoniche e della zona intronica
- 1 più basso corrispondente alle dimensioni delle sole zone esoniche
utilizando diluizione seriali dei campioni da valutare puoi stimare il grado di contaminazione.
ciao ciao
mi inserisco in questa discussione di qualche anno fa ormai...
io sn nuova nel campo e vorrei cortesemente chiederti se potresti spiegarmi cos intendi per disegnare i primer su una parte di gene in cui zone esoniche fiancheggiano un'introne.
grazie mille per l'eventuale risposta...grazie |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2012 : 13:30:43
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In pratica consiglia di porre i primer su due esoni diversi.
Se hai contaminazione da genomico, amplificherai anche l'introne che essi comprendono e vedrai una banda di dimensioni maggiori di quella attese per un'amplificazione da cDNA. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2012 : 21:10:33
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| grazie 0barra1.esauriente come sempre.grazie per aver risposto! |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2012 : 21:35:16
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| Figurati, compatibilmente con tesi da terminare e mie conoscenze dell'argomento, rispondo (quasi) sempre volentieri. |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Discussione |
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DNA genomico
Didattica
