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staminale
Nuovo Arrivato
Città: Roma
28 Messaggi |
 Inserito il - 31 ottobre 2006 : 13:16:10
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ciao a tutti,
dovrei fare un'estrazione di RNA partendo da pochissime cellule (circa 1 milione) ho provato a farlo con il kit della promega ...ma non sono riuscita a recuperare l'RNA...(effettivamente il protocollo raccomandava di utilizzare minimo 1 milione e mezzo di cellule!!!)
Pensavo ora di provare con il TRIZOL...leggendo il protocollo ho visto che per le cellule in sospensione, si usa 1 ml di trizol per 5 -10 milioni di cellule!!!IL mio dubbio è se questa è anche la quantità minima di cellule da cui si può partire per fare una buona estrazione dell'RNA usando questo reagente!!!
Qualcuno sa darmi un consiglio??
Vi ringrazio anticipatamente
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atreliu
Amministratore
Prov.: Milano
Città: Milano
2484 Messaggi |
 Inserito il - 31 ottobre 2006 : 15:14:18
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La domanda mi sorge spontanea.. e come mai non puoi avere più cellule?
Di che linea si tratta? |
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staminale
Nuovo Arrivato
Città: Roma
28 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2006 : 16:38:24
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Purtroppo non riesco ad ottenerne di più ...poichè lavoro con cellule staminali purificate da sangue di cordone ombelicale...e amplificarle non è facile!
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alessandra |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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staminale
Nuovo Arrivato
Città: Roma
28 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2006 : 13:31:06
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Grazie GFPina, il tuo suggerimento sarebbe stato utilissimo se avessi potuto comprare un nuovo kit...ma per ora non è possibile...quindi visto che il TRIZOL è l'unica cosa che abbiamo a disposizione nel laboratorio(oltre il kit promega che nel mio caso non da buoni risultati)dovrei sapere se l'uso di questo reagente in particolare potrebbe essermi utile!!!
Sei stata comunque carina ad impegnarti per aiutare una povera biologa ...disperata!!!
grazie!!! |
alessandra |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2006 : 19:19:53
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Ciao staminale!
Scusa non avevo capito il problema! Lo so spesso la soluzione più semplice non è facile... comprare nuovi kit non sempre si può.
Ma non disperare forse c'è un modo per risolvere il tuo problema!!!
Premessa:
l'estrazione con Trizol (che è una modifica del metodo fenolo-cloroformio) è più efficiente rispetto alla lisi con i kit su colonnina, ma il problema è la riprecipitazione in etanolo che ti fa perdere parte del materiale, se parti da poco materiale questo comporta un notevole problema!
A questo punto hai due possibilità aggiungere un carrier che coprecipiti con l'RNA (come ti consigliano anche nel data sheet del triziol: http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/15596026.pdf)
oppure accoppiare i due metodi di estrazione:
(non so quale sia il kit della promega a cui ti riferisci ma presumo che sia un metodo di estrazione su colonnina)
Parti a fare l'estrazione con trizol è poi dopo aver aggiunto l'etanolo fai passare il tutto attraverso la colonnina e procedi con il protocollo del kit, così dovresti avere una resa maggiore! 
(questo metodo si usa anche per l'isolamento degli small-RNA)
Ti consiglio però se ne hai la possibilità di fare una prova con delle altre cellule che non siano così preziose come le tue staminali!
Spero stavolta di esserti stata di maggiore aiuto!
Ciao  |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 novembre 2006 : 16:24:52
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Ciao Alessandra,
forse non mi sono spiegata bene!
Devi procedere con l'estrazione con Trizol fino a quando hai la divisione tra fase acquosa e fase organica, poi recuperi la fase acquosa, aggiungi etanolo e fai passare il tutto nella colonnina (continui dal protocollo del kit al punto in cui ti dice di mischiere l'etanolo al tuo lisato e caricare sulla colonnina).
Ho dato un'occhiata al protocollo del tuo kit promega... in effetti è un po' diverso rispetto agli altri kit, hai dei passaggi in più (ad es. il trattamento con DNasi direttamente sul filtro non l'avevo mai sentito, io l'ho sempre fatto dopo l'eluizione...mah... si impara sempre qualcosa di nuovo!)
Comuque se fai una ricerca in google con "Trizol" e "column" trovi alcuni protocolli adattati per fare quello che ti ho detto!
ad es. questi:
http://www.microarrays.be/Mini%20RNA%20Preparation%20Protocol%20For%20Microarray%20Applications.htm
http://www.kcl.ac.uk/depsta/healifsci/genomic/protocols/RNA_isolation_trizol_column.doc
e poi su un'altro forum hanno discusso a lungo di questo, penso ti possa essere utile leggere le loro opinioni (io so che questo metodo si può fare ma non l'ho mai provato personalmente! ), inoltre come dicono anche qua c'è anche l'opzione di usare un carrier come il glicogeno
http://www.protocol-online.org/forums/index.php?showtopic=12473&hl=
P.S. mentre ti sto rispondendo non so cosa succeda al forum, mi è sparita un paio di volte la pagina ed è sparita la tua ultima risposta... 
scusa ma non mi ricordo se c'era qualche altra domanda!
Ciao
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
 Inserito il - 07 novembre 2006 : 17:10:10
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Citazione:
il trattamento con DNasi direttamente sul filtro non l'avevo mai sentito, io l'ho sempre fatto dopo l'eluizione...mah... si impara sempre qualcosa di nuovo!
Lascia perdere Pina....non mi esprimo su cosa penso del kit di estrazione dell'RNA della Promega, ma sopratutto sul trattamento con DNAse,sono sicura che hai capito ugualmente ....Noi l'abbiamo provato e non funziona come dovrebbe, e non solo a noi.
Citazione:
Grazie GFPina, il tuo suggerimento sarebbe stato utilissimo se avessi potuto comprare un nuovo kit...ma per ora non è possibile...quindi visto che il TRIZOL è l'unica cosa che abbiamo a disposizione nel laboratorio
Scusami, sai, ma come si fa a non avere 300 euro (non sono sicurissima per il micro, ma il lipid costa +o- tanto)per poter acquistare un kit che vedrai ti cambierà tutto. Noi avevamo dei problemi grossissimi perchè dai lipidi estrai pochissimo RNA, ma la Qiagen ha il metodo lipid che è veramente notevole. Se proprio non avete soldi prova a chiedere al rappresentante di zona della Qiagen se te ne fa provare, son sicura che non ti dirà di no. |
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 15 giugno 2012 : 13:51:24
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Citazione:
oppure accoppiare i due metodi di estrazione:
(non so quale sia il kit della promega a cui ti riferisci ma presumo che sia un metodo di estrazione su colonnina)
Parti a fare l'estrazione con trizol è poi dopo aver aggiunto l'etanolo fai passare il tutto attraverso la colonnina e procedi con il protocollo del kit, così dovresti avere una resa maggiore!
(questo metodo si usa anche per l'isolamento degli small-RNA)
mi riallaccio a questa vecchia discussione per sapere se voi avete mai provato ad accoppiare i due metodi..ovvero far seguire alla lisi con trizol estrazione con colonnine. se si sareste così gentili a dirmi che protocollo avetre seguito? grazie mille |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 15 giugno 2012 : 18:54:04
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Citazione:
Messaggio inserito da 283
mi riallaccio a questa vecchia discussione per sapere se voi avete mai provato ad accoppiare i due metodi..ovvero far seguire alla lisi con trizol estrazione con colonnine. se si sareste così gentili a dirmi che protocollo avetre seguito? grazie mille
Io rileggerei la risposta di GFPina che c'è sopra... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 giugno 2012 : 19:49:40
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Visto che i link che avevo messo 6 anni fa non sono più disponibili ti metto anche questo: http://www.maizearray.org/files/RNA_Isolation_Using_Trizol_And_Qiagen_RNAeasy_Columns.pdf
comunque sopra spiegavo come fare e come trovare i protocolli, se poi vuoi sapere se l'ho fatto veramente: Sì, ma tanto tempo fa (se non al tempo di questa discussione poco dopo) quindi non mi chiedere di ritrovarti il protocollo che ho utilizzato, ma sicuramente non era altro che quelli che ho postato!
A volte bisogna anche provare le cose, non c'è sempre qualcuno che ha fatto esattamente la stessa cosa che devi fare tu e che ti può dire passo per passo cosa fare! |
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Discussione |
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poche cellule per estrazione RNA
Didattica
