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car86
Nuovo Arrivato

Citt�: foggia

12 Messaggi

Inserito il - 20 luglio 2012 : 14:23:08

Ciao a tutti!
Avrei una domanda da farvi.. come si prepara un feeder layer?
Vorrei usare delle staminali mesenchimali come supporto per cellule staminali embryonic-like.
Dopo che le mie mesenchimali hanno raggiunto il livello di confluenza, bisogna irradiarle o ci sono altri modi per inattivarle?
Va bene usare la mitomicina C? I raggi UV?
Non l'ho mai fatto e vorrei avere qualche consiglio!
Grazia in anticipo a tutti!
C86

Citosina
Nuovo Arrivato

Citt�: Milano

73 Messaggi

Inserito il - 20 luglio 2012 : 23:34:40

Io ho sempre usato i fibroblasti murini embrionali (MEF) come feeder e quello che facevo era di farli arrivare quasi a confluenza, successivamente li trattavo con la mitomicina C. In breve prendevo la petri con le cells e aggiungevo direttamente al terreno la mitomicina C (se ricordo bene a una concentrazione finale di 0.01mg/ml). Facevo movimento a croce e lasciavo in incubatore a 37�C per 1 ora e 30 minuti o anche 2 ore. In seguito eliminavo il terreno con la mitomicina e facevo due lavaggi in PBS. A questo punto stacchi le cells come per splittarle (con trispsina) e poi li puoi piastrare nelle nuove petri alla densit� che preferisci. In genere ti consiglio di testarne a diverse densit� e vedere cosa � meglio. In ogni caso prima di mettere le staminali, aspettavo due-tre giorni. Il probelma con i fibroblasti � che dopo due settimane circa stavano veramente male e cominciavano a staccarsi in quanto il terreno era per ES e non pi� per fibroblasti quindi dovevi sempre avere 'scorte' di feeder freschi pronti da usare. Ora con un feeder di staminali mesenchimali non saprei, per�.

(la mitomicina che avevo io dovevi prepararla prima, in genere prendevo quella della sigma in polvere e poi la scioglievo in modo da avere una soluzione stock. Poi la conservavo a 4�C e al riparo dalla luce)

car86
Nuovo Arrivato

Citt�: foggia

12 Messaggi

Inserito il - 23 luglio 2012 : 11:16:11

Grazie mille per la risposta! Far� un tentativo con le mesenchimali, per� su alcuni lavori ho letto che vanno bene come feeder layer. Il mio dubbio era fondamentalmente se bastava inattivarli con la mitomicina, o se bisognava irradiarli.. Grazie ancora!!!
Car86