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joleee80
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Prov.: Napoli
Città: napoli
24 Messaggi |
 Inserito il - 20 febbraio 2007 : 12:34:37
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grazie ai lettori e a chi mi ha risposto.
ho già clonato la proteina intera,ora essendo interessata alla porzione C terminale volevo clonare solo questa regione magari con un His-tag all'N-terminale.
il vettore che dovrei utilizzare è un pQE30 fornito dalla quiagen,la sequenza che vorrei inserire è di 303bp (la sequenza completa della proteina è circa 800 bp), e come enz di restrizione avevo pensato a BamHI e HindIII.
ciò che mi rende perplessa è di "azzeccare" il frame e di limitare il numero di a.a. tra l'his-tag e il frammento di interesse.
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Ciò che mi nutre .......mi distrugge.... |
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barbapapà
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10 Messaggi |
 Inserito il - 20 febbraio 2007 : 14:45:26
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Il mio consiglio è questo:
amplifica la sequenza di 303 bp che ti interessa clonare nel vettore pQE, con due primers che ti farai sintetizzare ad hoc e con queste caratteristiche:
la seq in 5' di ciascun primer conterrà un sito di restrizione e la seq in 3' sarà complementare alla regione che vuoi clonare.
Mi spiego meglio: il primer forward avrà nella regione in 5' il sito BamH1/HindIII e nella regione 3' una seq complementare alla seq da clonare; il primer reverse avrà in 5' il sito di restrizione per HindIII/BamH1 e in 3' la seq complementare.
Esegui una PCR e purifica l'amplificato da gel.
L'amplificato (lineare) avrà i due siti di restrizione (da digerire) alle due estremità.
OK?
Digerisci l'amplificato con i due enzimi di restrizione e quindi clonalo nel pQE precedentemente digerito con i due enzimi.
Cosa fare per il frame?
Verifica quanti nucleotidi ti è indispensabile aggiungere nella sequenza del primer forward tra il sito di restrizione e il frame della tua proteina e verifica che i codoni che si generano siano codificanti e non codoni di stop. Meglio se codificano per aa neutri.
Spero di essermi spiegato bene.
In bocca al lupo,
fammi sapere
ciao
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joleee80
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: napoli
24 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2007 : 10:59:47
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Carissimo barbapapà ti ringrazio per la risposta.ti allego anche la sequenza che devo amplificare con i 2 primer che penso di utilizzare. che ne pensi??
Grazie ancora dell'aiuto!!!!
Allegato:  PRIMER PROT DI FUSIONE.doc
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Ciò che mi nutre .......mi distrugge.... |
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barbapapà
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10 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2007 : 12:36:06
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Ciao
Secondo me dovresti rivedere le sequenze prestando attenzione alle Temperature di melting che ottieni. Mi spiego meglio.
Quando progetti il protocollo di PCR, devi considerare che durante i primi cicli si "annealeranno" solo le seq a valle dei siti di restrizione. Le Tm per queste porzioni di seq sono:
primer 1: 50.81°C
primer 2: 48.27°C
Il delta è di 2.54°, direi che può andare.
Per quanto riguarda il frame, non sono riuscita a trovare la seq dei vettori pQE. Se non ricordo male il codone di inizio + il tag di HIS sta sul vettore... controlla che l'inserzione non generi uno shift del frame di lettura.
Il codone di stop l'hai inserito tu....
Quindi per me può andare.
Fammi sapere se tutto funziona!
Ciao
Nei cicli successivi però la Tm sarà relativa all'intera seq. dei primers. E qui nascono un po' di problemi.
Con le tue seq, le Tm sono:
primer 1: 71.53°C
primer 2: 65.40°C
Il delta è di 6.13°C, direi un po' alto.
Perchè non provi a sostituire i primi 3 nucleotidi del primer 1 forward con A e T?
Se CGC diventano AAT, la Tm dell'intero primer 1 forward scende a 65.25°C. Perfetta!
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barbapapà
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2007 : 12:38:47
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Ccusa... c'è stata un'inversione nel mio testo. Ecco il testo corretto:
Ciao
Secondo me dovresti rivedere le sequenze prestando attenzione alle Temperature di melting che ottieni. Mi spiego meglio.
Quando progetti il protocollo di PCR, devi considerare che durante i primi cicli si "annealeranno" solo le seq a valle dei siti di restrizione. Le Tm per queste porzioni di seq sono:
primer 1: 50.81°C
primer 2: 48.27°C
Il delta è di 2.54°, direi che può andare.
Nei cicli successivi però la Tm sarà relativa all'intera seq. dei primers. E qui nascono un po' di problemi.
Con le tue seq, le Tm sono:
primer 1: 71.53°C
primer 2: 65.40°C
Il delta è di 6.13°C, direi un po' alto.
Perchè non provi a sostituire i primi 3 nucleotidi del primer 1 forward con A e T?
Se CGC diventano AAT, la Tm dell'intero primer 1 forward scende a 65.25°C. Perfetta!
Per quanto riguarda il frame, non sono riuscita a trovare la seq dei vettori pQE. Se non ricordo male il codone di inizio + il tag di HIS sta sul vettore... controlla che l'inserzione non generi uno shift del frame di lettura.
Il codone di stop l'hai inserito tu....
Quindi per me può andare.
Fammi sapere se tutto funziona!
Ciao
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joleee80
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: napoli
24 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2007 : 14:35:24
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Caro barbapapà,
ho di nuovo alcuni problemi...
1 in effetti dal programma di predizione oligo 4 i miei primer non vanno bene
2 non posso cambiare CGC in ATT nel primer forward perchè mi serve d'appoggio per l'enzima di restrizione
3 mi dici come hai calcolato il Tm perchè in base alla formula che ho applicato 4°C per G e C e 2°C per A e T mi trovo che il Tm dei primer è 54°C.
fammi sapere!!!!a presto |
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barbapapà
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10 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2007 : 16:16:55
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La formula che usi per calcolare il Tm è un po' grossolana (scusami il termine).
Questa è sicuramente più affidabile:
Tm = 69.3°C + 0.41 * (%GC) - 650/n
dove:
(%GC) è il valore % di G o C (es.: 53 e non 0.53, attenzione!)
n è la lunghezza del primer
Altrimenti esistono calcolatori on-line (molto più precisi), come per esempio quello che trovi a questo link:
https://www2.appliedbiosystems.com/support/apptech/#pcr_app
Immaginavo che la sostituzione dei nt così vicini al sito di restrizione non fosse facile...
Ho cercato anche altre soluzioni (tipo: aggiungere nt PRIMA del CGC) ma non ho trovato soluzioni valide.
Non saprei....
Dimmi: la tua proteina deve per qualche ragione particolare cominciare dal tct ??? Non si può spostare prima o dopo di qualche codone???
Altrimenti bisognerebbe trovare un altro sito di restrizione più adatto.
C'è nessuno che ha altre idee????
ciao
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joleee80
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: napoli
24 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2007 : 17:38:20
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cara barbapapà,
vorrei mantenere il sito di restrizione di bamHI però non sono vincolata sulla tripletta di inizio della proteina, poichè mi interessa la regione C terminale.
avevo scelto quella zona perchè per motivi di stabilità non posso clonare un frammento più piccolo di 10KDa e inoltre nella zona da me scelta non si formano strutture secondarie.però forse devo cambiare.
ti invio la seq. genica della proteina intera (tra l'altro già clonata).
ciaooo
Allegato: Seq gene SsMTAPII.doc
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sintesi di primer 2
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