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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
 Inserito il - 20 dicembre 2005 : 16:02:32
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devo rispondere a delle domande di genetica umana. tra cui:
1. Avete isolato un BAC di circa 200kb. Descrivete almeno 3 approcci sperimentali per individuare regioni trascritte.
2. attraverso il clonaggio posizionale é stato individuato un cDNA putativamente correlato ad una patologia autosomica recessiva unigenica. il cDNA é localizzato nella regione precedentemente individuata. Quali stategie usereste per validare il ruolo di questo cDNA nella patologia ereditaria in ogetto?
chi mi aiuta?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 20 dicembre 2005 : 21:03:35
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Dunque... alla prima domanda ti avrei saputo rispondere qualche anno fa probabilmente... ma al momento mi sfuggono soluzioni!!
Direi che un possibile approccio e' sicuramente quello in silico (sequenziare e trovare promotori putativi sulla sequenza), ma probabilmente c'e' qualcosa di piu' pratico.
Per la domanda 2 invece, direi che la cosa piu immediata da fare e' raccogliere campioni di DNA da pazienti e da individui controllo (nella stessa famiglia e al di fuori) e andare a valutare la presenza dell'allele in questione (es con PCR o probabilmente meglio con real-time PCR).
Visto che la malattia e' recessiva gli individui malati saranno omozigoti, alcuni dei familiari saranno portatori sani (eterozigoti), mentre al di fuori della famiglia non dovresti trovare l'allele in questione (o cmq lo trovi con bassa frequenza).
Inoltre dovresti costruire un albero genealogico per vedere la trasmissione del gene nella famiglia e confermare che sia davvero recessivo e autosomico.
Se poi esistesse un modello animale x la patologia potresti fare studi su questo es inserendo l'altro allele e valutando la remissione dalla patologia. Ad es ci sono studi del genere x la fibrosi cistica, dove trasfettano il gene del CFTR e se non ricordo male stavano addirittura passando a un trial clinico.
Altre cose da valutare, poi, sarebbero i fattori ambientali, che possono contribuire all'insorgere della malattia.
PS: conta che il le patologie autosomiche recessive unigeniche probabilmente sono poche decine.
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Miss Adenina
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
45 Messaggi |
Inserito il - 21 dicembre 2005 : 12:38:10
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per quanto riguarda la 1a domanda ( cioè verificare se il frammento di DNA clonato nel vettore BAC contiene sequenze trascritte) potrei suggerirti:
1) identificazione di isole CpG: infatti, nei vertebrati, la maggior parte dei geni che si esprimono costitutivamente ed alcuni fra quelli invece regolati presentano al loro 5' regioni con un'alta densità di isole CpG ipometilate. Si potrebbe quindi andare alla ricerca di eventuali isole CpG che presentano siti di riconoscimento per enzimi di restrizione del tipo "rare cutter" (usando enzimi isoschizomeri, cioè che riconoscono la stessa seq bersaglio ma con la differenza che un enzima la riconosce se metilata, la'tro se non è metilata).
2) Exon trapping: strategia che permette di recuperare eventuali regioni esoniche presenti all'int del frammento clonato. in caso di risposta positiva a questo test si avrebbe così la certezza di essere in presenza di una regione trascritta.
3) zoo blot: si sottopone la seq clonata ad ibridazione con seq codificanti di altre specie (dal momento che molte seq uniche sono conservate tra le specie).
4) ibridazione con gli mRNA dello stesso tessuto (quindi con l'intero pool dei trascritti della cellula) da cui è stato isolato il frammento clonato.
sono solo idee quindi verificane un pò correttezza...
ciao ciao  |
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Miss Adenina
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
45 Messaggi |
Inserito il - 06 gennaio 2006 : 21:12:42
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prego! |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 09 gennaio 2006 : 18:20:16
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grazie mille!
non ho avuto modo di connettermi per ringraziarti!
non te la prendere miss! mi sei stata di grande aiuto!
cià |
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prossima biologa
Utente Attivo
1437 Messaggi |
Inserito il - 12 novembre 2012 : 11:48:53
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| riporto su questo topic perchè volevo chiedere: alla domanda 1, quella dove miss adenina ha postato tutte queste soluzioni, posso aggiungere che posso cercare in banca dati ETS se ci sono sequenze ETS CHE IBRIDANO? Perchè le ETS sono sequenze che sicuramente sono espresse. |
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prossima biologa
Utente Attivo
1437 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2012 : 11:48:14
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inoltre oltre all'exon trapping, possiamo fare anche l'intrappolamento del promotore, stessa tecnica ma che prevede di clonare in BAC, non un frammento in un sito di clonaggio presente nell'introne ma bensi di frammentare il DNA con enzimi di restrizione,e in ogni clone ci sarà un gene target come per esempio la GFP e quindi se quel DNA è un gene, avrà anche un promotore, e mi aspetto che uno dei frammenti sia proprio il promotore e che quindi farà esprimere la GFP.
questo in linea teorica è un approccio sperimentale, ma non usato perchè complicato.
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domande genetica umana
