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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
 Inserito il - 11 dicembre 2012 : 16:47:48
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Salve a tutti
Avrei bisogno d aiuto...
Devo fare una ligation e non so da che parte rifarmi, visto che le variabili sono molte..
Il mio inserto "pesa" 273 bp mentre il vettore è 5364 bp (già digeriti con enzimi di restrizione). Estremità coesive e non compatibili.
La ligasi che ho acquistato è della Invitrogen (https://products.invitrogen.com/ivgn/product/15224017?ICID=search-product). Vi allego anche il bollettino tecnico.
Non ho mai fatto niente del genere e sono veramente, VERAMENTE ignorante al massimo in materia.
Mi date qualche consiglio?
Una volta effettuata la ligation, lo step di verifica è il gel di agarosio?
Grazie davvero
G
Allegato:  711-011109 TB T4 DNA Ligase (1).pdf
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
 Inserito il - 11 dicembre 2012 : 19:37:24
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| Dalle tue domande sembra che ti abbiano presa e buttata di forza in un lab in cui non ci sia un leader un collega un qualcuno con almeno 6 mesi di esperienza nel lab che ti possa seguire |
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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
Inserito il - 11 dicembre 2012 : 20:26:17
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| Esatto.. |
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Scrambled
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 11 dicembre 2012 : 21:41:48
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ciao, ma devi fare un clonaggio?
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Scrambled
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 11 dicembre 2012 : 22:41:10
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io non ho mai fatto clonaggi, ma reminescenze di studi non ricordo della verifica della ligazione...in teoria(se non mi sbaglio) trasformi e poi verifichi l'inserzione mediante selezione, non so, tipo alcuni plasmidi hanno una resistenza ad un farmaco(mi sembra triptofano) che si attiva solo se un'altro gene presente sul plasmide viene interrotto, in questo caso dal tuo inserto.
boh spero di esserti stata utile
buona serata  |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 11 dicembre 2012 : 23:03:27
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Ciao Giulia,
ci sono molte discussioni sull'argomento, prova a cercare in quelle gia' pubblicate e se poi hai ancora dubbi ri-scrivi. La verifica piu' semplice comunque e' la trasformazione, niente corse su gel...
@Scrambled: il triptofano un farmaco? Booouuuuummmmmm |
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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
Inserito il - 12 dicembre 2012 : 09:19:55
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Grazie Spemann, avevo già dato un'occhiata, ora guarderò + approfonditamente.Ho scritto da capo solo per sapere se secondo voi si trattava di un caso "standard" come lunghezze dei frammenti e se qualcuno aveva usato la ligasi T4 della invitrogen.
Grazie anche a Scrambled per la risposta.
Vi farò sapere. Intanto proverò le condizioni standard e chiederò aiuto a un ragazzo di un altro gruppo.
PS: Patrizio quando ho letto la tua risposta m è presa male xche è proprio così, sono l'unica che fa qst cose nel mio gruppo, e anche in tutto il dipartimento...le mie risorse sono Google e Youtube quindi son messa maluccio! Più che altro mi sento proprio scarsa, a perdermi in queste cose che sono le basi...ma non le ho mai fatte...se non sui libri! Se penso che le fanno in tesi triennale, mentre io sono alla fine del 1° anno di PhD...
Scusate lo sfogo! |
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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
Inserito il - 12 dicembre 2012 : 09:42:15
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Scusate, vi chiedo un paio cosine e non vi tormento più...
1) temperatura e tempo di incubazione: consigliano 22-26°C per 1h... che dite, se lascio ON è meglio?
2) quantità di DNA: se calcolo 10 fmol di vettore e 30 di inserto, ottengo circa 18 ng e circa 3 ng, rispettivamente. Sono pochi secondo voi?
3) trasformazione: come faccio a calcolare la quantità di soluzione da usare? Do per scontato che la quantità di plasmide ottenuta sia pari al DNA totale usato?
4) per inattivare l'enzima, meglio usare l'EDTA o l'incubazione a 70°C?
GRAZIE GRAZIE GRAZIE!!!!!!!!!!!!  |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 12 dicembre 2012 : 14:55:00
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1) per adesso attieniti al protocollo, i casi in cui ho fatto ligazioni on la temperatura prescelta è stata di 14-16°C anziché RT;
2) pochissimi direi, credo serva un microgrammo di DNA per l'inserto. Per avere un'idea delle proporzioni tra vettore ed inserto carico su gel un uguale volume per i due e a fine corsa visualizzo l'intensità delle bande. Se vedo che intensità banda inserto/intensità banda vettore = 1/6, per dire, e desidero un rapporto di 3:1 inserto-vettore per la mia ligazione, so che dovro' ricorrere a 18 volte più inserto (rispetto al vettore);
3) per 50 uL di DH5alpha aggiungo tra 1 e 5 uL di prodotto di ligazione, a seconda dell'efficienza che mi aspetto. Talvolta effettuo più trasformazioni con il medesimo prodotto di ligazione;
4) mai inattivata la ligasi, a ligazione conclusa passo alla trasformazione direttamente e l'aliquota restante viene conservata a -20°C, dove l'attività dell'enzima dovrebbe tendere a zero. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 12 dicembre 2012 : 18:20:57
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Io faccio avvenire la ligation O/N a 4°C.
Per quanto riguarda le quantità, non supero mai i 100 ng totali, in modo da non inibire l'attività enzimatica. In pratica aggiungo dai 30 ai 50 ng di vettore e l'inserto in base al rapporto molare scelto. |
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Scrambled
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 12 dicembre 2012 : 18:39:02
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ahahha oddio cosa avevo scritto..ovviamente intendevo resistenza a terreni selettivi.... 
in bocca al lupo Giulia! |
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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
Inserito il - 13 dicembre 2012 : 09:47:03
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Grazie mille a tutti per i preziosi consigli!!!
@roberta: la ligasi che usi è quella della Invitrogen? |
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