Quantificare l'espressione genica

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Robertyna
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6 Messaggi

Inserito il - 13 dicembre 2012 : 10:59:09

Salve a tutti, avrei bisogno di un aiuto: vorrei sapere come fare a indicare i livelli di espressione di un gene rispetto a uno di riferimento, e come farlo per uno stesso gene confrontando l'espressione dei campioni con quella del controllo.
I geni sono stati amplificati con la RT-PCR.
Come si effettua l'anasisi relativa?
Vi prego, gentilmente di darmi una risposta.
Robertyna

kira89
Nuovo Arrivato

11 Messaggi

Inserito il - 30 dicembre 2012 : 23:47:56

per la quantificazione relativa di un mRNA tra campioni diversi si comparano i valori ci Ct (Ct= threshold cycle, ossia numero di cicli richiesti affinchè il segnale di fluorescenza possa diventare significativo rispetto al background).

Si utilizza un controllo endogeno per normalizzare la quantità di partenza di RNA, ciò vuol dire calcolare il ΔCt per ogni campione:
ΔCt= Ct gene target - Ct controllo endogeno.

Poi occorre definire un calibratore, cioè un campione di controllo che verrà utilizzato per comparare gli altri campioni; questo equivale a calcolare il
ΔΔCt = ΔCt campione - ΔCt calibratore.

infine possiamo calcolare la quantificazione relativa RQ = 2^(-ΔΔCT); questo parametro ci dice di quante volte il gene del campione è più espresso rispetto al controllo endogeno