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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
 Inserito il - 09 gennaio 2013 : 22:27:36
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Salve,
sto per effettuare una ibridazione in situ con sonda marcata con digossigenina. Ho bisogno che la mia sonda stia a 10ng/ul in volume finale di 150ul.
Quantizzando la sonda sul gel ho calcolato che sta a 25ng/ul
quindi che calcolo devo fare, il solito CiVi=CfVf...?
ovvero: 25ng/ul vi =10ng/ul x 150ul....ma viene un numero abnorme, ovvero 60ul sonda in 90ul buffer di ibridazione??non mi convince!
Dico che è abnorme perchè sono stata in un lab in cui non si ponevano il dubbio di quanta sonda utilizzare, e utilizzavano sempre e comunque 1ul ogni 50ul di buffer di ibridazione, così...
Poi, ora che lo devo fare da sola nel mio lab...mi rendo conto...
Vorrei solo sapere se faccio il ragionamento giusto...
Aiuto, please!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 10 gennaio 2013 : 20:01:24
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| Se hai una sonda a 25 ng/ul e vuoi andare a 10 ng/ul devi diluire 2.5 volte. Quindi se il volume finale è di 150 ul vuol dire che devi effettivamente mettere 60ul di sonda (150/60=2.5) e quindi 90ul di buffer. |
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 11 gennaio 2013 : 22:03:44
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avevo ragione quindi.....caspita, vabbè...
Altra domanda, sempre sull'ISH:
per la sonda va sempre fatta una miscela di dUTPs (marcati con digossigenina) e dNTPs nella miscela di PCR?
L'unica volta che l'ho fatto, avevo solo i dUTPs nella mix, oggi l'ho rifatta e non mi è uscito niente, mente la pcr controllo con i dNTPs normali è venuta. Ho letto che mettere tutti e due migliora la resa, ne sapete qualcosa?
grazzzzie sempre |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 11 gennaio 2013 : 23:47:42
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Citazione:
Messaggio inserito da Limpet
avevo ragione quindi.....caspita, vabbè...
Altra domanda, sempre sull'ISH:
per la sonda va sempre fatta una miscela di dUTPs (marcati con digossigenina) e dNTPs nella miscela di PCR?
L'unica volta che l'ho fatto, avevo solo i dUTPs nella mix, oggi l'ho rifatta e non mi è uscito niente, mente la pcr controllo con i dNTPs normali è venuta. Ho letto che mettere tutti e due migliora la resa, ne sapete qualcosa?
grazzzzie sempre
si va messo anche il ribonucleotide non marcato (a più alta concentrazione di quello marcato per giunta!), altrimenti rischi di ingolfare la reazione. Per rendervi le cose più semplici vi consiglierei di comprare la mix già bella che pronta, fornita dalla Roche:
http://www.roche-applied-science.com/proddata/gpip/3_6_12_2_5_1.html
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"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 12 gennaio 2013 : 12:06:52
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| Avevo letto di questa mix già pronta, ma quello che non capisco è perchè si ingolfa? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 12 gennaio 2013 : 12:38:01
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Citazione:
Messaggio inserito da Limpet
... ma quello che non capisco è perchè si ingolfa?
Secondo te?
Biotin-16-dUTP |
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 12 gennaio 2013 : 15:45:59
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| ..ingombro della regione spaziatrice e della biotina (o digossigenina), immagino.. |
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2013 : 17:20:47
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Riprendo questa vecchia discussione per la preparazione della sonda. Ho comprato i Dig-UTPs della roche marcati con digossidenina per fare sonda, e mi consigliano di preparare una miscela di dATP, dGTP, dCTP 2mM, dNTP 1,3mM e poi DIG-dUTP 0,35mM.E fin qui, tutto chiaro.Poi nella PCR per la sonda devono esserea 0,035mM e fin qui anche tutto bene.Il problema è a monte.Per quanto mi senta una vera ebete a chiederlo, i DIG-dUTP sono a 25nmol in 25µl, quindi....
Non ho problemi a preparare i dNTPs non marcati a queste concentrazioni (i miei sono a 100mM), ma per quelli marcati, 25nmol vuol dire 25nmol/µl e che quindi che sono 0,000025mmol???
grazie, |
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 24 marzo 2013 : 19:51:07
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Insomma, per capirci. Nel volume di PCR per fare la sonda, quanti microlitri di Dig-UTPs devo aggiungere in un Volume finale di 40µl per averli a 0,35mM????
merci, |
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Sonda per ISH- ng & co
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