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Autore

Discussione

Lord Garland
Nuovo Arrivato

3 Messaggi

Inserito il - 22 maggio 2013 : 22:45:39

Ciao a tutti. Io ho un serio problema:

mi serve come avere un certo promotore genomico. Se estraggo DNA da una cellula, come procedo per isolarmi quel preciso promotore?

Provo a buttare l� un'ipotesi; ditemi se siete d'accordo o no o se conoscete altre possibilit�: sono tutt'orecchi:

ho una cellula --> estraggo genomico --> Uso enzimi di restrizione per spezzettarmi il DNA (qui non so molto - chi mi illustra questo punto?) --> user� enzimi di restrizione che non tagliano il mio promotore --> faccio una PCR con il primer Forward e Reverse del mio promotore --> Lo isolo e lo uso per lo studio. E' giusto?

SpemannOrganizer
Utente

Citt�: Los Angeles

955 Messaggi

Inserito il - 23 maggio 2013 : 18:43:14

Se conosci la sequenza non ti serve digerire il genomico. Basta estrarlo e con i primers che ti sei disegnato (sempre ovviamente che tu conosca la sequenza) ti fai una bella PCR per amplificarlo. Io ho fatto cos� per un promotore di Xenopus laevis.

zerhos
Utente Junior

Prov.: Pisa
Citt�: Pisa

421 Messaggi

Inserito il - 24 maggio 2013 : 21:54:07

Tecnicamente � sufficiente una PCR come dice il saggio SpemannOrganizer, tuttavia il grosso del problema dei promotori � capire dove esattamente inizino!!!!!.
Per convenzione quando si amplifica un promotore nuovo, si amplificano "n-kilobasi" subito a monte dell'atg (codone di inizio della traduzione). A monte dell'atg troverai sicuramente la 5'utr del gene (se esiste) e quindi la sequenza del promotore propriamente detto, e se sei sfortunato diversi introni(anche mooolto grossi) tra l'atg e il tuo promotore agognato. Il punto di problema � che le sequenze regolatorie del tuo promotore possono essere sparse anche a valle di esso, quindi nella 5'utr del gene, negli introni (capita molto spesso) e addirittura all'interno della sequenza tradotta (0_0).
Tutto questo per dire che isolare un promotore non � cosa affatto banale!

"l'unica differenza tra me e un pazzo � che io non sono pazzo!"
Salvador.Dal�

domi84
Moderatore

Citt�: Glasgow

1724 Messaggi

Inserito il - 25 maggio 2013 : 00:39:53

Dai un occhio qui se � stato gi� caratterizzato il promotore del tuo gene:
http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=home

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
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