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liciageno
Nuovo Arrivato
107 Messaggi |
 Inserito il - 09 luglio 2013 : 12:09:08
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Ciao,
Devo dimostrare che l'effecienza di amplificazione del mio target e del mio reference gene sono sono uguali e quindi devo fare un validation experiment. E' la prima volta che lo faccio e vorrei chiarimenti a riguardo. Io devo fare delle diluizioni del mio cDNA giusto?
Da quanto devo partire per fare le diluizioni? E cosa vuol dire farle 100 fold range? Ho un problema su questo punto.
In seguito devo semplicemente amplificare i miei campioni diluiti (target e reference)
Vi ringrazio per eventuali chiarimenti
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picchiasebino
Nuovo Arrivato
Città: roma
52 Messaggi |
Inserito il - 09 luglio 2013 : 19:39:04
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Ciao. Provo a risponderti...
Prima domanda: giusto.
Seconda domanda: solitamente una validazione si effettua dopo che si conosce la concentrazione iniziale di carico di un DNA. Ma si può ovviare per tentativi con le diluzioni(vd dopo).
Terza domanda: significa una diluizione (seriale) 1:100. Es. un microlitro di soluzione DNA in 99 microlitri di acqua.
Come fare? Sappiamo che una diluizione 1:2 produrrà un delta CT di 1 tra il non diluito e il diluito. Con una diluizione 1:100 il delta CT sarà di 6.6. Facendo più diluizioni seriali 1:100 dovremo controllare che i delta CT tra le diluizioni rispettino i valori di 6.6. In tale caso la efficienza sarà del 100%.
Come facciamo a capire la concentrazione di partenza? Se non abbiamo dati o protocolli a cui appoggiarci possimao fare così: solitamente, quando la quantità di DNA caricata è eccessiva il delta CT tra il non diluito e il diluito successivo è più piccola del dovuto (< 6,6 in questo caso), dovuto al fatto che il CT del non diluito non riesce ad anticipare.
Spero che i concetti siano chiari e che possano darti delle risposte. In caso potremmo scendere nei particolari per il calcolo dell'efficienza.
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liciageno
Nuovo Arrivato
107 Messaggi |
Inserito il - 10 luglio 2013 : 13:07:54
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Ho capito il concetto dell'esperimento. Tuttavia non ho capito la seguente frase: "Sappiamo che una diluizione 1:2 produrrà un delta CT di 1 tra il non diluito e il diluito" e se fai invece una dil 1:100, il delta ct sarà 6.6...
Il resto mi è chiaro.
TI ringrazio |
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picchiasebino
Nuovo Arrivato
Città: roma
52 Messaggi |
Inserito il - 10 luglio 2013 : 14:12:34
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In PCR Real Time, ad ogni CT di differenza corrisponde un quantitativo di DNA del doppio o della metà del precedente. Cioè: se il campione di DNA X ha un'uscita di CT di 30, il campione diluito 1:2 (la metà) avrà un'uscita di 31 (delta = 1). La sua diluizione 1:4 uscirà a 32 (delta = 2); la diluizione 1:10 avrà un delta = 3,32; la diluizione 1:100 avrà un delta di 6.64.
Se hai bisogno di chiarimenti non farti problemi. Validare metodi fa parte del mio lavoro. |
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liciageno
Nuovo Arrivato
107 Messaggi |
Inserito il - 10 luglio 2013 : 16:57:25
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Si ho capito, grazie, molto chiaro.
Il calcolo che si fa è log in base 2 di 10=X che viene appunto in questo caso 3,3 circa.
Ma perchè si applica il logaritmo? log in base 2 perchè ci riferiamo ai dimezzamenti 1:2? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 10 luglio 2013 : 18:37:10
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Perché ad ogni ciclo di PCR hai un "raddoppio" del DNA:
è quello il significato del 2! |
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picchiasebino
Nuovo Arrivato
Città: roma
52 Messaggi |
Inserito il - 10 luglio 2013 : 18:43:59
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| Certo. |
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liciageno
Nuovo Arrivato
107 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2013 : 17:15:04
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| ok Grazie, adesso è chiaro :) |
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qRT-PCR validation experiment?
Didattica
