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alessandro.gori
Nuovo Arrivato



10 Messaggi
Inserito il - 10 marzo 2014 : 12:27:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di alessandro.gori Invia a alessandro.gori un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti. Dovrei controllare se il senso del mio gene clonato è messo nel senso giusto. Posso farlo tramite PCR senza sequenziarlo ?grazie.

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi
Inserito il - 10 marzo 2014 : 14:18:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si certo, basta che utilizzi un primer sul tuo gene e uno sul plasmide, vicino a dove è inserito il gene.
Se è inserito correttamente hai amplificazione altrimenti no. (o meglio, in teoria amplificheresti tutto il plasmide che però è grosso e con i tempi per amplificare il frammento non riusciresti a vedere la banda).
Poi se vuoi anche un controllo, per vedere l'inserto inserito invertito, puoi fare un'altra PCR usando invece l'altro primer del tuo gene (che essendo inserito al contrario funzionerà al contrario, il reverse funziona da forward e vice versa)
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alessandro.gori
Nuovo Arrivato



10 Messaggi
Inserito il - 11 marzo 2014 : 11:02:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di alessandro.gori Invia a alessandro.gori un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Quindi avendo un primer forward del plasmide (T7FORWARD) ed il reverse del mio gene posso controllare se è inserito correttamente a valle del plasmide ?
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi
Inserito il - 11 marzo 2014 : 14:08:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da alessandro.gori

Quindi avendo un primer forward del plasmide (T7FORWARD) ed il reverse del mio gene posso controllare se è inserito correttamente a valle del plasmide ?

Sì
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alessandro.gori
Nuovo Arrivato



10 Messaggi
Inserito il - 11 marzo 2014 : 15:22:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di alessandro.gori Invia a alessandro.gori un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
OK grazie mille GFPina per il prezioso aiuto!!! Ho già fatto la PCR e ho ottenuto dei cloni positivi!!! Grazie ancora e buon lavoro!
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