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Concentrazione Mg PCR

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Autore

Discussione

Lia79
Nuovo Arrivato

9 Messaggi

Inserito il - 15 dicembre 2014 : 10:44:42

Prover� una PCR con diverse temperature di annealing, ma mi domandavo come giocare con le concentrazioni di Mg.

Di solito uso una concentrazione 1.5 mM di Mg. Quali altre concentrazioni potrei provare (considerando anche che devo incrociarle con 3 temperature di annealing)?

Grazie!

midichloria
Nuovo Arrivato

75 Messaggi

Inserito il - 15 dicembre 2014 : 12:36:00

Io normalmente uso la taq Phusion. Con questa taq la concentrazione di MgCl2 deve essere 0,5-1 mM pi� elevata rispetto alla concentrazione dei dNTPs. Per esempio se la concentrazione finale dei dNTPs � 200 �M, io di solito uso una concentrazione finale di 0.8 mM di MgCl2.
In presenza di EDTA per� la concentrazione va aumentata di un po'.
Bisogna fare attenzione a non esagerare altrimenti diminuisce la specificit� dei primers e quindi del tuo prodotto finale.

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 16 dicembre 2014 : 20:31:54

La Phusion non � una Taq!

Se utilizzi una Taq la concentrazione di Magnesio ottimale � tra 1,5-2 mM, ma si pu� diminuire fino a 0,5 o aumentare fino a 4.

Se vuoi aumentare la resa devi aumentare la concentrazione di magnesio, mentre se vuoi aumentare la specificit� devi diminuirla.

Io comunque non farei troppe prove tutte assieme, inizia a provare una PCR con diverse Ta e la stessa concentrazione di magnesio, poi in base al risultato vedi cosa cambiare.