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bio_Logos
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16 Messaggi |
 Inserito il - 26 luglio 2009 : 13:08:04
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Ciao, spero di aver azzeccato la sezione giusta per postare questa domanda.
Sto studiando biologia molecolare e mi sono imbattuto nel sistema Cre/LoxP che, nel complesso, ho capito come funziona. Il problema è che spiegano ovunque come si prepara il costrutto e come si fa la selezione delle cellule embrionali che contengono il gene che deve essere modificato, ma il mio dubbio è:
come si crea un topo che esprime la ricombinasi Cre in uno specifico tessuto? si tratta di un knock in? Il meccanismo è lo stesso che per l'inserimento di un transgene con sequenze LoxP (nel senso che bisogna sempre mettere dei marcatori neo e TK)?
Grazie anticipate per le risposte...
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ukitel
Nuovo Arrivato
78 Messaggi |
Inserito il - 06 agosto 2009 : 21:16:32
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Sì, il topo per esprimere la recombinasi Cre è un knock-in.
Non c'è bisogno del sistema neo-tk.
Il sistema neo-tk serve per individuare le cellule che hanno effettuato una ricombinazione omologa. Nel knock-out questo è essenziale perché devi sostituire una sequenza di DNA che il topo ha già.
Nel caso del knock-in non hai bisogno di ricombinazione omologa, perché devi introdurre una sequenza di DNA che il topo NON ha (quindi non può ricombinare).
Fai una "semplice trasfezione" (non so di preciso con che metodo la trasfezione venga effettuata) introducendo il plasmide con il gene Cre e il promotore tessuto specifico nella cellula. Poi speri che si integri, ma il sito di integrazione per te non è importante, quindi puoi usare anche un solo marcatore, che può essere vario, va bene anche GFP. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 agosto 2009 : 23:56:49
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E' semplicemente un "topo transgenico" classico.
(puoi vederti la differenza tra topo transgenico e topo KO) anche se come discutevamo qui: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=13381
la differenza è un po' sottile.
Tra l'altro il metodo più utilizzato per fare un topo cre è appunto il topo "transgenico" (inserzione random), ma esistono anche topi CRE fatti mediante ricombinazione omologa. |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2009 : 11:09:40
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| Poi se lo fai transgenico puoi decidere se farlo tramite transfezione, microiniezione, infezione... |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2009 : 21:46:26
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uhmm... ci sono molte imprecisioni nelle risposte vediamo di rispondere alle domande una ad una.
"come si crea un topo che esprime la ricombinasi Cre in uno specifico tessuto?"
semplice, basta mettere a monte del cDNA di Cre un promotore tessuto specifico o inducibile.
Esistono diversi metodi, il più utilizzato è prendere un promotore tessuto specifico (es Promotore della Nestina, dell'aldolasi C, etc) metterlo a monte del cDNA di Cre... poi questo costrutto si mette in un punto qualsiasi del genoma. Si ottiene così un topo transgenico classico. E' relativamente semplice, ma la genotipizzazione è un casino, fidati, poiché è difficile sapere quando il topo è omozigote.
L'altra possibilità è di fare un knock-in, ci sono di versi locus inutilizzati con promotori e tutto ciò che serve per esprimere un RNA, basta inserire il tuo cDNA in maniera precisa in quel punto ed il risultato è simile al precedente. Il casino è che si conoscono pochi locus, ed è difficile prendere le zone di omologia, e poi è anche difficile che il profilo di espressione di questi locus sia proprio quello che vuole il ricercatore.
La terza possibilità è la più elegante ed incasinata, l'ho fatto proprio poco tempo fa. Ovvero sostituire la regione codificante di un gene X con il cDNA della Cre... anche qui tessuto specificità, tempo dipendenza dell'espressione e tutto, insieme ad un knock-out... Se ci sai fare, dà dei risultati molto interessanti.
"si tratta di un knock in?"
Knock-in indica una certa precisione nell'inserimento del tuo cDNA di Cre, è ininfluente nel topo Cre.
Può esserlo o no, l'importante è mettere a monte di Cre un promotore tessuto specifico ad oc,
"Il meccanismo è lo stesso che per l'inserimento di un transgene con sequenze LoxP (nel senso che bisogna sempre mettere dei marcatori neo e TK)?"
I "marcatori di selezione" ci vanno sempre, servono per riconoscere quelle cellule che hanno integrato stabilmente il tuo DNA, senza questi non è possibile ottenere una selezione.
Esistono rari casi, davvero pallosi, in cui generi un topo senza questi marcatori, purtroppo me ne sono capitati 2, non sono semplici ed è meglio non discuterne qui.
I marcatori, in linea generale, ci vanno sempre, poiché l'efficienza di ricombinazione è molto bassa, per avere un'idea si tratta di 1-2 su qualche milione di cellule se va bene, se va un po' maluccio 1-2 su qualche miliardo.... senza un marcatore di selezione sarebbe impossibile riuscire a trovare queste cellule ricombinate.
Ovviamente la situazione è diversa dall'inserimento delle sequenze LoxP, il topo cre in linea generale è molto più facile da ottenere, i LoxP generalmente richiedono molte più cautele.
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princy
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9 Messaggi |
Inserito il - 17 settembre 2009 : 09:11:47
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Mi sfugge qualcosa sui knockouts...
l'esempio che c'è sul testo è questo:
Il DNA ricombinante costruito è un plasmide con un gene per la timina kinasi e con l'inserto inattivato dall'inserimento del gene per la resistenza alla neomicina. A questo punto, le cellule staminali di topo vengono transfettate col DNA ricombinante ottenendo tre tipi di cellule : quelle in cui il gene interrotto si è ricombinato col cromosoma cellulare; quelle il cui genoma è andato incontro a ricombinazione non omologa per cui presentano il gene interrotto e il gene tk; quelle in cui non si è verificata alcuna ricombinazione.
La domanda è : "visto che si sta usando un plasmide e tutte e tre le cellule lo contengono, il gene interrotto e quello per la timidina kinasi non vengono replicati ed espressi anche senza ricombinazione?
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 17 settembre 2009 : 09:29:32
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uhmm... non so se ho capito bene la tua domanda
in genere non si mette il gene della timidina chinasi, ma il promotore di questo gene poiché consente una espressione molto forte del cDNA a valle. Ovviamente il cDNA è quello della resistenza alla neomicina.
Sì tutte le cellule avranno il tuo costrutto che però durerà molto poco dato che si deve necessariamente linearizzare per avere la ricombinazione omologa.
questo significa 2 cose importantissime
1) questo vettore non si potrà replicare all'interno delle cellule target per cui ha un'emivita breve
2) il DNA linearizzato e trasfettato in cellule è degradato abbastanza rapidamente
per cui transfetti per elettroporazione, poi aspetti qualche giorno e cominci la selezione con l'antibiotico.
Dato che il vettore non si può replicare solo quelle cellule che integrano questo DNA nel proprio genoma potranno sopravvivere, e dato che l'emivita del DNA linearizzato è breve ( <48 hr ) anche le cellule che hanno alte quantità di questo vettore non potranno dare resistenza.
Secondo alcuni, non tutti i ricercatori me compreso, il DNA linearizzato non può trascrivere nulla poiché non è superavvolto, quindi a maggior ragione sopravvivono solo le cellule ricombinanti.
spero di essere stato chiaro
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princy
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9 Messaggi |
Inserito il - 17 settembre 2009 : 09:44:41
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| Wow, rapido e chiarissimo. Ti ringrazio tantissimo. Però...un'altra cosa: il vettore viene linearizzato con un'endonucleasi presumo.Ma una volta transfettato, una ligasi cellulare non potrebbe farlo circolarizzare? Non sarebbe meglio usare un vettore senza l'origine di replicazione della cellula eucariotica? |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 17 settembre 2009 : 10:58:37
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Le ligasi a cui tu fai riferimento sono quelle procariotiche o virali... nelle cellule eucariotiche questa reazione è improbabile, sebbene non impossibile.
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princy
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 17 settembre 2009 : 11:38:21
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Scusa, avevo fatto un pò di confusione  sto studiando anche i vettori shuttle, ecco perchè.. Comunque adesso mi è tutto chiaro
Grazie infinite |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 17 settembre 2009 : 23:02:27
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Scusate non capisco una cosa
Il gene della timidina chinasi si introduce, sì,
per operare la selezione negativa delle cellule
andate incontro a ricombinazione non omologa
(ossia random insertion): che io sappia è una
procedura che viene fatta con il gancyclovir. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2009 : 01:16:26
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la corretta inserzione nel DNA genomico si deve fare necessariamente con il southern blot. La doppia selezione di cui tu parli non lo evita il southern, per cui la maggioranza dei ricercatori non fa questo tipo di selezione. Io, infatti, nonostante abbia fatto tantissimi topi transgenici e di tutti i tipi, non ho mai utilizzato il cDNA della timidina chinasi e né l'ho visto fare. Invece é diffusissimo l'uso del suo promotore per la resistenza all'antibiotico, o per un cDNA target, insieme ad altri ovviamente.
Ripeto che non escludo la sua utilità ed il suo utilizzo, ma nella mia esperienza non l'ho visto neanche considerare per la selezione
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2009 : 01:24:03
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Immagino che l'utilità effettiva di questa selezione aggiuntiva
dipenda, in effetti, dall'efficienza relativa con cui avviene
ricombinazione omologa (di solito rara) e random insertion (non
so quanto frequente, ma immagino più frequente della HR).
Se eliminando le cellule che sono andate incontro al secondo
evento si riesce a ridurre il numero di cloni ES da sottoporre
a southern per validarne il gene targeting, immagino sia solo
un vantaggio (in termini squisitamante operativi).
Io però non l'ho mai fatto direttamente.
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Francesco Marr
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2015 : 16:41:15
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Salve a tutti,
anche io mi trovo a studiare il metono Cre/LoxP per la costruzione di topi transgenici; non sono riuascito a capire come effettivamente vengono create queste linee Cre/loxP.
Quello che inizialmente avevo capito è che per avere un topo transgenico cre/loxp si fanno incrociare due linee di topo, la linea cre ( nella maggior parte dei casi sotto il controllo di un promotore) e la line loxP con il gene che deve essere inserito (oltre che ad un gene reporter). Il risultato finale è un topo che esprime il gene che si vuole studiare nel sito di interesse; questo perchè la ricombinasi cre indotta, taglia la sequenza contenuta tra i siti LoxP che può essere legata covalentemente ed essere saccessivamente inserita nella sequenza di Dna.
Poi ho letto che per ottenere un topo transgenico si deve avere un ricombinazione omologa tra le sequenze Cre e le sequenze Cre/loxP,quasi ad intendere che il transgene che normalmente inserisci nelle cellule staminali è una sequenzqa cre/loxp.
la mia domanda è quale dei due procedimenti, sopra descritti, è il metodo cre/loP per la costruzione dei topi trangenici?
Ci sono vicino o se sono lontano dalla soluzione?
vi ringrazio in anticipo |
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Topi transgenici Cre/LoxP
Didattica
