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kiko6361
Nuovo Arrivato
Città: Verona
37 Messaggi |
 Inserito il - 27 maggio 2010 : 16:57:21
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Salve a tutti.
Nei prossimi giorni devo estrarre del DNA, per far fare l'analisi genetica, da una linea cellulare pancreatica che cresce in adesione.
Al di là di staccare le cellule con tripsina, ecc qualcuno di voi potrebbe suggerirmi un protocollo che vada bene al mio caso? Da quante cellule partire?
 ringrazio fin da ora.
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
 Inserito il - 29 maggio 2010 : 20:00:23
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ciaooo
devi tripsinare le cellule e lavarle con PBS 1X per pulirle
poi una volta lavate le centrifughi e hai di nuovo un pellet
estrai il DNA da quello come una normale estrazione di DNA
se hai un kit... usi quello
se no... nel sito ci sono 2 protocolli per estrarre DNA
e li trovi buffer di lisi
ti do le linee guida
l'idea e'
una volta ottenuto il pellet
devi lisare le cellule per far uscire il DNA
e usi un buffer lisi e di solito PK
quindi il DNA e' in soluzione
centrifughi e trasferisci la soluzione in una nuova eppendorf
e ora devi precipitare il DNA
isopropanolo o etanolo vanno bene
centrifughi e hai un pellet che contiene il tuo DNA
lavi con etanolo 70%
e poi risospendi in TE o acqua sterile
vedi i protocolli che sono sul sito
e per la quanita' di cellule un 10alla6 e' piu' che sufficiente
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Gabry
Nuovo Arrivato
Prov.: Ancona
Città: santa maria nuova
64 Messaggi |
Inserito il - 31 maggio 2010 : 13:00:18
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bisogna vedere per cosa ti serve il DNA. io ho provato ad estrarre il DNA con Kit e con il metodo Trizol (simile a quello che hai scritto miky76) però la resa della reazione è sempre bassa anche partendo da 10alla 6 di cellula.
ciao |
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kiko6361
Nuovo Arrivato
Città: Verona
37 Messaggi |
Inserito il - 01 giugno 2010 : 14:20:00
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Ciao e grazie delle risposte. Il trizol non va bene nel mio caso, perchè la resa è bassa. Il DNA è per fare analisi genetica, analisi di CFTR. Ho visto un protocollo su internet ma non so cosa è HIRT buffer.
Non ho soldini per un kit 
tutto a manooooo
Grazie |
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kiko6361
Nuovo Arrivato
Città: Verona
37 Messaggi |
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 01 giugno 2010 : 17:24:12
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ciaooo
se non hai i soldi
allora non comprare il Trizol
e' caro e per estrarre il DNA per genotipare puoi fare un buffer di lisi fatto in casa e usare PK
come descrive il protocollo che hai allegato o come suggerisce il protocollo "Estrazione DNA da code di topo" del sito
solo che se io fossi in te
se hai possibilita' di avere cellule facilmente
prima di complicarmi la vita con il passaggio fenolo/cloroformio del protocollo che hai trovato
proverei il protocollo standard per genotipare
"Estrazione DNA da code di topo"
e usi il buffer di lisi e PK del protocollo che hai
per fare una PCR non serve un enorme quantita' di DNA
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kiko6361
Nuovo Arrivato
Città: Verona
37 Messaggi |
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miky76
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 03 giugno 2010 : 13:10:39
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ciaooo
si il Trizol e' ottimo per RNA
ma non l'ho mai usato per il DNA
e il protocollo che hai trovato e' lo stesso che uso io per estrarre
il DNA da code di topo
funziona perfettamente e mai avuto problemi per una PCR per genotipare
ma per sequenziare.... non so
magari dovrai pulire meglio il DNA
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kiko6361
Nuovo Arrivato
Città: Verona
37 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2010 : 14:04:56
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Rieccomi qui dopo aver applicato il protocollo ho ottenuto il mio bel DNA:
Concentrazione DNA = 894,5 ng/µl
260/280 = 1,99 (260 picco DNA; 280 picco proteine)
260/230 = 2,19 (260 picco DNA; 230 contaminazioni fenoli, ecc)
L'ho fatto correre su gel d'agarosio all'1% per vedere che non fosse degradato. Il DNA è ok ma ho 2 bande ad altezza di circa 1550 e 2500. Immagino che sia RNA....confermate?
Come lo tolgo? Avete un protocollo da suggerirmi per favore?
GRAZIE
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2010 : 14:37:15
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| Sei sicuro che sia RNA? se è quello direi di aggiungere delle RNasi (in genere si usa un mix RNasiA + RNasiT). Io nn ho molta esperienza di estrazione DNA genomico, ma se è in buone condizioni hai una bella banda netta che migra molto alta (nel mio caso a circa 10000 ma potrebbe essere di più)... se è degradato hai un bello smear. Non so se quelle due bande possano corrispondere a RNA.. (di RNA si vedono in genere le bande dell'rRNA 25S e 18S e, a volte, 5S ma nn ricordo a che altezza migrano, poi se non sei in condizioni denaturanti la migrazione è alterata). |
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kiko6361
Nuovo Arrivato
Città: Verona
37 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2010 : 15:53:55
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Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
Sei sicuro che sia RNA? se è quello direi di aggiungere delle RNasi (in genere si usa un mix RNasiA + RNasiT). Io nn ho molta esperienza di estrazione DNA genomico, ma se è in buone condizioni hai una bella banda netta che migra molto alta (nel mio caso a circa 10000 ma potrebbe essere di più)... se è degradato hai un bello smear. Non so se quelle due bande possano corrispondere a RNA.. (di RNA si vedono in genere le bande dell'rRNA 25S e 18S e, a volte, 5S ma nn ricordo a che altezza migrano, poi se non sei in condizioni denaturanti la migrazione è alterata).
Ciao SpemannOrganizer, si sono sicura che è RNA 25, 18 e 5 s  . Ho la banda del DNA bella netta sopra ai 12000 e poi queste tre bendine che corrispondono all'RNA.
Ho trovato un protocollo:
Add 1ul of a 10 µg/mL (=10 ng/µL) stock solution of RNase A to your DNA and incubate at 37şC for 30 min. Recover the DNA by adding 1/10 volume of 3M sodium acetate (pH 6.8) and 2 volumes of isopropanol or 95% ethanol to the DNA containing solution. Incubate on ice for 10 min Centrifuge at maximum speed for 5 min at room temperature, to pellet the DNA. Discard (carefully) the alcohol. Wash with 70% ethanol and dry DNA. Dissolve in TE or dH2O, as you did in the DNA extraction.
 la domanda è:a quanto DNA devo aggiungere quella quantità di RNAasi??
 non ne vengo fuori!
grazie |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2010 : 17:01:38
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| Mah... sul mio protocollo ho una concentrazione 10 volte maggiore di RNasi (100 ng/ul)ma nn è specificato a quanto DNA va aggiunta. Credo che le due cose non siano in relazione, nel senso sarebbe più logico usare una certa quantità di RNasi in relazione a una certa quantità di RNA. Tieni infine conto che l'RNasi è usata in eccesso, in modo da assicurarsi la totale eliminazione dell'RNA. Se non hai fatto questo passaggio prima, penso dovrai riestrarre il genomico per ripulirlo dalla RNasi introdotta (poi magari dipende da cosa ci devi fare). |
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ChiaraLu
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 26 gennaio 2016 : 12:06:41
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Ciao Kiko6361!
Sono nuova del forum, l'ho utilizzato molte volte in realtà a livello consultivo, ma mi sono iscritta solo oggi dopo aver letto questa discussione proprio per poterti chiedere se hai risolto il tuo problema utilizzando quella RNase e seguendo quel protocollo... Ho il tuo stesso problema e sono abbastanza disperata... E' un po' vecchiotto questo post, ma spero tu possa rispondermi comunque! Nel caso replico tutto quello che hai fatto tu alla lettera!
Grazie mille! |
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Discussione |
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Estrazione DNA/RNA da linea cellulare in adesione
Didattica
