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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
 Inserito il - 17 maggio 2007 : 22:52:01
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Chi di voi fa trasfezioni (o transfezioni)?
Qual è la differenza a livello pratico se si vuole ottenere una trasfezione stabile anzichè una trasfezione transiente?
Io credo che si definisce stabile una trasfezione che comporta l'integrazione di DNA esogeno nel DNA genomico della cellula ricevente.
L'antibiotico per il quale il plasmide conferisce resistenza, viene aggiunto al terreno di coltura quando?
1) I primi giorni anche quando vogliamo ottenere solo una trasfezione stabile?
2) Subito dopo i primi giorni e per 10-15 giorni in modo da selezionare solo le cellule che hanno integrato il plasmide nel genoma?
3) Sempre in presenza di cloni stabili, cioè quando abbiamo dei cloni stabili va sempre aggiunto l'antibiotico nel terreno?
Alcuni mi hanno invece detto che si possono ottenere cloni stabili anche quando il DNA plasmidico non è integrato nel genoma, ma è presente in maniera episomale. Secondo questi ricercatori, si ha l'integrazione nel genoma solo quando si utilizzano dei vettori virali.
Esperti di trasfezione rispondete!!!
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 17 maggio 2007 : 23:20:03
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Eccomi qua...
Devi sapere che, aldilà delle definizioni "da manuale", qualsiasi transfezione
canonica comporta l'integrazione del DNA in sede cromosomale. Se così non fosse
il DNA episomale sarebbe rintracciabile nel citoplasma, cosa che non accade mai
(fatta eccezione per quei plasmidi appositamente ingegnerizzati per la stabilità episomale)
La differenza sta altrove:
- In una transfezione TRANSIENTE non si procede ad alcun tipo di selezione,
per cui le cellule maggiormente esprimenti (cioè integranti il plasmide
presso loci ad alto enhancing trascrizionale) resteranno sempre
mischiate a quelle esprimenti il tuo DNA in misura minore e a
quelle con un'espressione nulla (per mancata assunzione del plasmide)
oppure terminale (l'hanno solo internalizzato e a breve lo degraderanno).
Per questo, e probabilmente per altri motivi, le colture transfettate
in modo transiente tenderanno a perdere la loro capacità di espressione
nel tempo, sia nella stessa coltura (per la degradazione del DNA internalizzato)
sia man mano che subiranno passaggi successivi, passaggi in cui le poche
cellule ad elevata espressione stabile verranno progressivamente perse,
- In una transfezione STABILE non si agisce in modo diverso, ma semplicemente
si procede entro pochi giorni dalla transfezione (io faccio 3 giorni, il tempo
necessario per essere sicuri che l'integrazione sia avvenuta e che ogni cellula
stia regolarmente esprimendo il prodotto del gene) ad un procedimento di SELEZIONE.
L'antibiotico più spesso usato per questa selezione è il G418, o genetecina, un
aminoglicoside analogo della neomicina (tant'è che il gene Neo(r) conferisce
resistenza pure ad esso) che va applicato a concentrazioni crescenti e poi
eventualmente abbassato (tipo una volta che il grosso delle cellule non esprimenti
è stato 'fatto fuori'). Nella tua piastra di transfezione rimarranno delle singole
cellule resistenti che daranno vita a isolette monoclonali. Dopo il 'piccaggio',
cioè l'isolamento di ogni singolo clone, segue un periodo variabile ed in genere
medio-lungo (a volte un mese o più) nel quale il mantenimento dell'antibiotico
favorisce l'ulteriore selezione negativa dei cloni non sufficientemente resistenti.
Alla fine di questo lungo calvario potrai ottenere cloni cellulari esprimenti
il tuo prodotto genico in modo stabile nel tempo, da mantenere sempre
in terreno antibiotico, anche durante i successivi congelamenti.
Se non ti è chiaro qualcosa chiedi pure |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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_Feda
Nuovo Arrivato
Città: Roma
6 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2018 : 12:31:36
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Caro Dionysos,
quando parli di 'piccaggio' delle singole colonie, come viene fatto effettivamente in pratica?
Ti ringrazio! |
The important thing is not to stop questioning. Curiosity has its own reason for existing. One cannot help but be in awe when he contemplates the mysteries of eternity, of life, of the marvelous structure of reality. It is enough if one tries merely to comprehend a little of this mystery every day. |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 16 marzo 2018 : 00:40:58
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| Ci sono dei mini-cilindri di plastica sterili, vanno umettati con una specie di silicone sterile, si mettono sul clone (che hai precedentemente segnato con una x sulla piastra) isolandolo. Metti una goccia di tripsina, il clone si stacca, spipetti un po' e lo metti in una piastra da 96... |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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