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real time pcr classica

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Autore

Discussione

adrenerg1co
Nuovo Arrivato

11 Messaggi

Inserito il - 20 settembre 2018 : 12:13:31

Ciao a tutti

Quali passaggi e strategie si devono fare per portare un protocollo di pcr classica ad uno di real time? si può fare sempre? cosa posso leggermi?

Grazie

domi84
Moderatore

Città: Glasgow

1724 Messaggi

Inserito il - 20 settembre 2018 : 12:31:39

In che senso?
Una pcr classica clona, una real time pcr quantifica, fanno due cose diverse, i primer saranno diversi (un amplificato di real time pcr non supera mai i 250pb).
https://toptipbio.com/real-time-pcr-primer-blast/

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...

adrenerg1co
Nuovo Arrivato

11 Messaggi

Inserito il - 21 settembre 2018 : 11:39:51

ci sono real time di presenza e assenza; a me interessa questo tipo ... l'amplificato è di 200 bp, penso che potrei usare anche gli stessi primer, e la proporzione con i reattivi e le temperature che non saprei impostare

GFPina
Moderatore

Città: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 24 settembre 2018 : 17:03:34

In genere se l'amplificato è abbastanza piccolo (200bp come il tuo caso vanno benissimo) e non hai aspecifici nella tua amplificazione, puoi usare gli stessi primers anche per una real-time, con SYBrGreen.

Per le condizioni devi vedere la mix di real-time che utilizzi e qual'è la DNA polimerasi utilizzata, perché le temperature di anealing variano anche in base alla polimerasi. Però basandoti sulle condizioni della end-point poi fare delle prove.