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Alessia
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
59 Messaggi |
 Inserito il - 23 febbraio 2007 : 22:32:47
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ciao a tutti. ho estratto da tessuto di colon rna per saggiare attraverso real time l'espressione di alcuni geni. ho estratto con trizol ho letto allo spettrofotometro e corso l'rna sul gel di agarosio allo 1.2%. al transilluminatore le due bande dell'rna ribosomiale erano bellissime!!!!!!!ho retrotrascritto e poi ho amplificato e....indovinate un pò??? non mi è nemmeno uscito il segnale dell'housekeeping!!!!! ollora ho provato a riestrarre un altro pezzo dello stesso campione e nonostante il gel mi dava delle belle bande alla realtime il gene costitutivo continuava a non dare segni di vita!!!!così ho fatto un controllo di qualità del kit di retrotrascrizione tante volte qualche componente fosse andato a male. ho messo di nuovo il mio campione in concomitanza con un altro campione che avevo gia retrotrascritto e che mi era uscito l'housekeeping in un altra analisi. indi retrotrascritti tutti e due li ho mandati di nuovo in real time e il controllo mi è uscito mentre il campione no. conclusione:non è il kit di retrotrascrizione a non andare. quindi la domanda sorge spontanea????COS'è????????
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Balsamo del Canadà
Nuovo Arrivato
Prov.: Verbano-Cusio-Ossola
Città: Verbania
97 Messaggi |
Inserito il - 24 febbraio 2007 : 10:32:43
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ciao alessia, io non ho esperienze con PCR real time e quindi ti chiedo se il template che usavi per la retrotrascrizione lo estraevi dal gel di controllo in agarosio. Io per sequenziare strutture geniche amplificavo con PCR e poi da gel prelevavo bande singole e spesso, nonostante la banda ottima, l'estrazione non dava niente di buono. Magari il passaggio che limita è la purificazione dal gel.. Però come ti ripeto non so quale sia il protocollo per il template della Real time!
Ciao |
-B.del C.- |
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Alessia
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
59 Messaggi |
Inserito il - 24 febbraio 2007 : 12:48:27
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per quanto concerne la realtime il gel elettroforetico si fa solo ed esclusivamente come controllo qualitativo dell'RNA indi per vedere se è degradato o contaminato da DNA. una volta fatta la foto il gel si butta. appurate le due bande belle e separate, ingenuamente, si pensa che si è fatta un'estrazione da paura!!! invece la sorte ti fa ricredere e all'analisi non ti esce neanche l'housekeeping!!!!! qiundi non riesco a capire cosa non deve essere andato |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2007 : 15:12:14
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Non fai il trattamento con DNAse prima dell'RT?
Hai lavorato sempre in ghiaccio?
L'RNA è stato conservato a -80°C?
Ci possono essere state contaminazioni da RNAse?
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Manz
Nuovo Arrivato
Prov.: MI, PV
Città: Milano, Mortara
27 Messaggi |
Inserito il - 28 febbraio 2007 : 15:20:20
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L'RNA disappearance è effettivamente un po' un palo per tutti.
Se nessuno dei reagenti del kit di retro che usi è contaminato (come escluderebbesi dalle tue prove) per escludere una possibile contaminazione del campione una cosa sensata sarebbe caricare su gel un tot di RNA appena estratto (come hai fatto), e a fianco una aliquota dello stesso tenuta a 37° - 50°C per una decina di minuti (per vedere se il campione stesso si "autodegrada").
Se, ancora, dopo il caricamento il pattern di bande è identico (cosa che non sarebbe se ci fosse contaminazione), sostituirei il buffer della TAQ con l'acqua di Lourdes. |
Come dici? Ma certo, che sono il prescelto! Non penserai mica che fosse quello stupido bambino biondo che spostava gli oggetti col pensiero, e che ha traslocato da casa questa mattina?
http://sabaroth.altervista.org/JMP/ - Journal of Molecular Proctology |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2007 : 13:10:26
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Caro Manz, sono anni che lavoriamo con l'RNA, ma nel nostro laboratorio non è mai capitato nulla di simile.
Alessia, hai provato a "vedere" il tuo RNA con uno strumento tipo il Bioanalyzer dell'Agilent o della Bio-Rad?
Hai provato a cambiare proprio campione ( ho visto che hai preso un altro pezzo dello stesso)sempre però di colon?
Come housekeeping usi il 18S?
Fammi sapere, sono molto curiosa, se poi hai risolto ed hai capito a cosa è dovuto diccelo, così ci arricchiremo tutti......
Grazie
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Alessia
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
59 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2007 : 12:07:22
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| alcuni campioni che sembravano contaminati da DNA li ho trattati con DNasi ma tra gli rna presunti degradati la maggior parte era quella che avevo trattato con DNasi. però ci sono altri che le bande erano nitide e che non necessitavano del trattamento però lo stesso nn mi davano segni di vita. i cambioni stanno rigorosamente a -80 e l'acqua che uso è depc che cambio di volta in volta per paura delle contaminazioni. l'housekeeping che uso è l'HPRT. ora un lab del piano di sotto mi ha detto che hanno un macchinario per vedere se l'rna è degradato o meno. non so come si chiama ma appena so qualcosa vi faccio sapere. inoltre dimenticavo..ho notato che estraendo più pezzi dallo stesso colon risultavano sempre bande belle ma alla realtime nessun segnale. ho provato in parallelo un controllo positivo e questo veniva quindi non so cosa possa essere. appena so qualcosa vi faccio sapere |
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Alessia
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
59 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2007 : 12:16:53
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gia che ci sono vi domando un'altra cosa... chi di voi che fa realtime usa sybergreen? se si come disegnate i primers cioè che programmi usate e per la determinazione delle Tm che prog usate?perchè ho notato che prog diversi danno Tm diverse è possibile? la matematica non è un'opinione? poi una volta che vi sono arrivate i primers come li testate con diluizioni standard? io uso applyedbiosystem. infine se la vostra efficienza è buona (io prendo primers che hanno un efficienza dal 90 al 110%) fate il deltaCt oppure se è scadente li tenete ugualmente facendo una curva standard interna (o esterna)??? fatemi sapere ciao Alessia |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 14 marzo 2007 : 14:57:34
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Scusa se è un po' che non rispondo, ma la mia capa è da oggi in maternità per cui non vi dico le corse finali....
Allora, non so cosa sia HPRT, noi usiamo il 18S o l' HMBS o il GAPDH.
Usiamo il Sybergreen, i primers li costruiscono con primer 3 o Omiga.
Hanno da poco stilato un protocollo per questo ed appena avrò tempo lo metterò nella sez. protocolli.
Quando arrivano i primers ce li portiamo tutti a 150micromolare,li usiamo in pcr diluiti 1:10,li proviamo quindi in semiquantitativa con i controlli pos e neg; la t°a non è detto che sia proprio quella che ti danno loro, fai le prove, è meglio.
Abbiamo sempre delle ottime efficienze.
Ciao |
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Bilogicalinformaticamente
Nuovo Arrivato
Prov.: Foggia
Città: Lucera
34 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2007 : 16:53:53
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| Quando si tratta di RNA si fa sempre una grande confusione! La cosa è più complessa di quanto possa apparire! Ne ho sentita una di storie e viste di cose strane a riguardo! Una persona non mi ricordo in quale forum web degli States diceva che si era autoriprodotto un E.Coli da Cellule Di Ameba lavorando su ribos! Parlando con lui poi ha ammesso che nello stesso laboratorio a distanza di pochi cent. vi erano tutte due le culture chissà che aveva combinato. Questo non esclude che possiamo trovarci in cose strane, ma solo che non si riesce mai a beccarne il meccanismo vero che produce quei ris |
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rna degradato?
Didattica
