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valeriamassa
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 Inserito il - 23 luglio 2007 : 11:10:54
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Ciao, devo clonare il mio gene in un vettore virale, ma devo prima inserire nei primer i siti di restrizione, come posso fare? All'oligo 5' devo avere il sito per XHO1 (CTCGAG) e all'oligo 3' il sito per HPA1 (GTTAAC). Come costruisco il primer in dettaglio? Devo mettere i siti di riconoscimento nudi e crudi o devo aggiungere delle sequenze fiancheggianti i siti di riconoscimento? Devo aggiungere anche delle regioni di appaiamento col c-dna del mio gene?? Grazie mille a chiunque mi fornisca chiarimenti e delucidazioni
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valeria |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2007 : 11:43:55
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Nei miei clonaggi costruisco 2 coppie di primer:
1) semplicemente i primer per il cDNA del mio gene d'interesse che mi servono ad amplificare il cDNA
2) una volta ottenuto il cDNA lo amplifico facendo una nasted con i primer che mi servono per aggiungere gli enzimi di restrizioni, generalmente costruiti con una porzioni TATA-seq enzima di restrizione-parte della regione di appaiamento del cDNA
Puoi fare anche direttamente i primer con la sequenza dell'enzima+la regione di appaiamento, in casi disperati ho fatto anche questo ma rischi di dover perdere un sacco di tempo per ottimizzare la pcr...
Ovviamente ricordati di revertire il primer reverse (3')...
Per altri dubbi chiedi pure...forse sono stata un po' troppo concisa... |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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valeriamassa
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Inserito il - 23 luglio 2007 : 11:46:19
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Biochica, devo però aggiungere delle sequenze che fiancheggiano i siti di riconoscimento dell'enzima di restrizione, o no?
e se sì, che sequenze devono essere?
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valeria |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2007 : 11:50:22
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| mmmmm...dovrei riguardarmi i primer ma mi pare proprio di no... |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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valeriamassa
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Inserito il - 23 luglio 2007 : 11:53:48
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| Hai per caso il catalogo della neb? Perchè lì dovrebbe esserci una tabella con le sequenze fiancheggianti |
valeria |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2007 : 12:01:47
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il catalogo della neb lo trovi in rete...
ho rivisto tutti i miei primer e sono disegnati senza sequenze fiancheggianti... |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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valeriamassa
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64 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2007 : 12:06:42
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| su internet c'è scritto che sono richieste delle sequenze fiancheggianti il sito di riconoscimento con la funzione di stabilizzare l'annealing degli oligo e facilitare il teglio. Sul sito della neb non riesco a trovare la sezione che mi indica le sequenze fiancheggianti, però sono certa che sul catalogo cartaceo c'è la tabella. Non riesco a trovare il catalogo in lab, tu ce l'hai per caso? |
valeria |
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valeriamassa
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2007 : 12:14:57
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Figurati...cmq prova a vedere anche su primer 3, credo ti dia la possibilità di aggiungere code ai primer...
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Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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valeriamassa
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Inserito il - 23 luglio 2007 : 12:36:20
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| sul sito dei primer3 dici? Tu sai usarlo? Non trovo l'opzione che ti permette di aggiungere code! Sono tecnologicamente-negata! |
valeria |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2007 : 13:40:12
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| Io uso un altro programma ma vedo se riesco a darci un'occhiata |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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valeriamassa
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Inserito il - 23 luglio 2007 : 13:55:09
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| biochica, abuso della tua pazienza e disponibilità per porti un'altra domanda: se faccio una doppia digestione usando un enzima che produce estremità coesive ed un altro enzima che produce estremità piatte blunt, avrò problemi poi nel ligare? |
valeria |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2007 : 14:03:29
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| Non ho mai fatto niente del genere ma non credo...io non sono un'amante delle doppie digestioni a dire la verità...ho sempre preferito tagliare prima con un enzima, dializzare sui dischi di nitrocellulosa della millipore e digerire con il secondo enzima...ci perdo più tempo di sicuro ma ho avuto un po' di casini con le doppie digestioni con siti di taglio troppo vicini e preferisco così... |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2007 : 14:07:14
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| Ho guardato su primer3, in effetti l'inserimento dei siti di restrizione manca...io uso vector NTI dell'invitrogen se magari hai qualcuno che ce l'ha... |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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valeriamassa
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64 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2007 : 14:13:38
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| grazie della preziosa consulenza! |
valeria |
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come costruire primer con siti di restrizione?
Didattica
