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Leonardo
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
 Inserito il - 16 novembre 2005 : 12:58:00
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VI PREGO POTETE AIUTARMI CIRCA LE SEGUENTI TECNIKE KE MI VERRANNO KIESTE ALL'ESAME DI BIOLOGIA MOLECOLARE?
SE SI VI PREGO DI ESSERE KIARI PRECISI E DI NON TRALASCIARE ALCUN PASSAGGIO.CI TENGO XKè DAVVERO NON SO DOVE SBATTERE LA TESTA E RIUSCIRE IN QUESTO ESAME MI AIUTEREBBE TANTISSIMO VISTO KE SONO MOLTO INDIETRO.
-ESTRAZIONE DELGI ACIDI NUCLEICI
-IL SEQUENZIAMENTO DEL DNA
-GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE E LE MAPPE DI RESTRIZIONE.ESTREMITà PIATTE ED ESTREMITà COESIVE
-L'ELETTROFORESI SU GELDI AGAROSIO,IL BROMURO DI ETIDIO
-IL BLOTTING
-IBRIDAZIONE E IMPIEGO DI SONDE
-CLONAGGIO:IL DNA RICOMBINANTE,I VETTORI,LA SELEZIONE,L'ATTIVAZIONE
X favore rispondetemi se potete al mio indirizzo email: leonardo05@freemail.it
inviandomi un email x ogni tecnica
Il mio grazie sarà una continua preghierà affinchè abbiate tutta la sana gioia possibile x la vostra vita!e credetemi:la preghiera fa miracoli.ve lo posso assicurare x lho sperimentato nella mia vita.
GRAZIE DI CUORE
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"La felicità è come una farfalla:più cerchi di afferrarla più ti scappa.Trova il coraggio di star fermo e ti si poserà sulla spalla" |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2005 : 13:55:01
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Wow! Posso scriverci un libro su tutte queste cose!
ESTRAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI
L'estrazione di DNA e RNA viene fatta ovviamente partendo 1) da un tessuto (animale o vegetale) o 2) da cellule in coltura.
Metodo usato in pratica
Usi un kit di estrazione di acidi nucleici... facile, veloce, devi solo leggere le istruzioni del kit!
Metodo che ti chiedono all'esame (o che fai se non hai i $$$ x comprare il kit)
1) Se parti da un tessuto ovviamente avrai un primo passaggio di dispersione delle cellule che dipende un po' da che tessuto stai usando. Ad esempio un tessuto molto fibroso (es. un muscolo o una foglia) andra' tritato mentre un tessuto piu' soffice (es. cervello) puo' essere semplicemente disperso schiacciandolo o usando un sonicatore.
Se invece parti da cellule dovrai "scraparle" (ok, fa schifo, ma non so la traduzione dell'inglese scraping... insomma staccarle dalla piastra dove crescono) se crescono adese, mentre se crescono in sospensione basta centrifugare in modo da far precipitare le cellule.
Questo primo passaggio (sonicazione, scraping etc) si fa in un buffer di lisi che permette di rompere le cellule in modo da far uscire il DNA. Il buffer di lisi contiene: Sarkosyl o altro detergente (es. Tween 20) che lisa le cellule, proteinasi K (x eliminare le proteine), sali vari (Tris, NaCl, EDTA).
A seconda del materiale di partenza puo' essere utile lasciare la digestione per diverso tempo. Alla fine un passaggio a 60-70 gradi elimina la proteinasi K.
2) A questo punto aggiungi ugual volume di fenolo:cloroformio 1:1 pH 8 (alcuni mettono anche alcool isoamilico, ma sinceramente io non l'ho mai aggiunto e ha sempre funzionato benissimo!). E' consigliabile presaturare il fenolo con TE.
[nota tecnica] Ovviamente tutto il lavoro con il fenolo va fatto sotto cappa e con molta attenzione perche' il fenolo e' altamente cancerogeno. [fine nota tecnica]
3) mixare fino a ottenere un'emulsione...
4) centrifugare 1-2 min >12000rpm. Otterrai due fasi: acquosa in alto e organica in basso. Tra le due fasi un sottile layer biancastro dall'aspetto piuttosto schifoso  costituito da proteine.
5) Recuperi la fase acquosa senza toccare le proteine e la fase organica e la metti in un altra provetta. Butti via la fase organica (ovviamente nell'apposito contenitore x i rifiuti tossici)
6) Ripeti gli step 2->5 fino a non avere piu' proteine.
7) A questo punto aggiungi un ugual volume di cloroformio e ripeti gli step 4-6 in modo da eliminare il fenolo (puoi farlo un paio di volte)
8) Aggiungi 1/10 vol di sodio acetato 3M, mix (alternativamente si puo' usare LiCl, NaCl o NH4Ac)
9) Metti a -80 per almeno 1 ora o -20 almeno o/n
10) Centrifuga a >12000 rpm x almeno 30 min. Il pellet contiene l'RNA. Proseguire con il passaggio 12
11) Recuperare il surnatante (che contiene ancora il DNA).
12) Aggiungi 2 vol di EtOH 100% tenuto a -20 (pare vada bene anche la vodka dal freezer... ma non ho provato) al surnatante per precipitare il DNA.
10) Metti a -80 per almeno 1 ora o -20 almeno o/n
11) Centrifugare 30min o piu' a >12000 rpm a 4 gradi.
12) Eliminare il surnatante, sciacquare con EtOH 70%
13) Lasciare evaporare l'etanolo (o usare una pompa a vuoto)
14) Risospendere il pellet in TE. Si puo' trattare il DNA con RNAsi e l'RNA con DNAsi.
Possibilmente lavorare in banconi separati x DNA e RNA in modo da evitare contaminazioni.
Scusa ma ora sono le 2 di notte e quindi vado a nanna... 
Domani ti rispondero' a qualcos'altro! Su gente, rispondete anche voi... non fatemi scrivere un'enciclopedia!
Ciao
nICO
PS: ho tolto l'altro post uguale a questo. Evitiamo il cross-posting! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2005 : 14:11:54
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Citazione:
da Leonardo (ops... avevi risposto a un altro topic)grazie mille x la tua repentina risposta!tutto kiaro.solo un dubbio:cosa indichi con la silga TE ?
TE sta per Tris-EDTA. E' una soluzione di 10 mM Tris-HCl pH 7.8 + 1 mM EDTA, tipicamente usata per dissolvere DNA/RNA (puoi usare anche acqua ma con il TE e' piu' stabile).
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2005 : 14:22:51
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L'ELETTROFORESI SU GELDI AGAROSIO,IL BROMURO DI ETIDIO
E' una tecnica che ti permette di visualizzare acidi nucleici.
Consiste nel fare un gel di agarosio, un particolare carboidrato estratto da un'alga (che se non ricordo male si chiama agar-agar) ad un'estremita' del quale si "carica" del DNA.
Il gel contiene anche bromuro di etidio, un intercalante, cioe' una sostanza con struttura simile a una coppia di basi che puo' insinuarsi all'interno della doppia elica. Il bromuro di etidio e' visualizzabile con luce UV.
Metti questo gel all'interno di un buffer e applichi un campo elettrico (con il + dalla parte opposta a dove hai messo il DNA).
Poiche' il DNA e' carico - andra' verso il +. Inoltre le maglie del gel di agarosio faranno resistenza e le molecole piu' lunghe di
DNA migreranno piu' lentamente.
Un po' di tempo dopo aver applicato il campo elettrico, mettendo il gel su una sorgente di UV puoi vedere dove sta l'etidio (quindi il DNA).
Se hai caricato anche uno standard con pezzi di DNA a lunghezza nota puoi vedere quanto e' lungo il tuo frammento.
Queste tecniche sono un po' difficili da spiegare cosi' a parole... prendi un qualsiasi libro di biologia molecolare: troverai una figura molto piu' esplicativa.
SEQUENZIAMENTO
Guarda qui : http://www.molecularlab.it/laboratorio/tecniche/sequenziamento.asp |
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Leonardo
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2005 : 11:33:06
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| cosa si significa che le basi azotate degli acidi nucleici sono altamente coniugate? |
"La felicità è come una farfalla:più cerchi di afferrarla più ti scappa.Trova il coraggio di star fermo e ti si poserà sulla spalla" |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2005 : 01:09:36
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Enciclopedico nICO!! Invidio la tua pazienza/costanza!
Cmq concordo con lui,
su un libro di bio mol faresti molto prima!
già solo contando l'aiuto delle immagini... |
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biotech
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
170 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2005 : 11:42:57
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Attenzione all'etidio che è cancerogeno... Non respirare i suoi fumi.
ENZIMI DI RESTRIZIONE
Si chiamano così perchè riconoscono e tagliano una precisa sequenza del DNA; sicocme non so bene come spiegarti la differenza tra estremità piatte ed estremità coesive ti faccio un disegno:
5' AGGTCTTC...
3' TCCAGAAG...
Queste sono le estremità piatte, cioè che non presentano protuberanze o code.
...AGGTCTTC 3'
...ACC 5'
Queste sono invece estremità adesive, cioè che presentano una coda in questo caso in direzione del 5'. Sono le migliori queste, perche consentono di formare legami ad idrogeno con un frammento complemntare alla coda e quindi di legarsi saldamente.
Le estremità piatte rendono molto più difficile la chiusura del vettore perchè non c'è la possibilità di formare legami ad idrogeno, ma bisogna utilizzare solo una ligasi.
Spero di essere stata chiara.
Per quanto riguarda le mappe di restrizione devi confrontare i vari frammenti ottenuti da diversi tagli, ma ne ho fatta una sola e non è che l'abbia fatta tanto bene. Spero che qualcuno su questo possa aiutarti meglio di me.
Ti ringrazio per le tue preghiere, perchè adesso ne ho bisogno. ;)
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http://boincstats.com/signature/user_1342603.gif |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2005 : 11:56:27
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Citazione:
Messaggio inserito da Leonardo
...VI PREGO POTETE AIUTARMI CIRCA LE SEGUENTI TECNIKE KE MI VERRANNO KIESTE ALL'ESAME DI BIOLOGIA MOLECOLARE?...
SE SI VI PREGO DI ESSERE KIARI PRECISI E DI NON TRALASCIARE ALCUN
Io ti potrei suggerire un paio di libri di testo interessanti:
1) K. Wilson, J.M. Walker - "Metodologia Biochimica", Raffaello Cortina Editore
2) A. Maggi - "Biotecnologie Farmacologiche", Masson
Il primo spiega, anche abbastanza bene, tutte le tecniche di lab (è un po' carente nella parte di elettroforesi capillare).
Il secondo è un po' più specifico sulle tech biomol (forse fa più al caso tuo) |
http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2005 : 12:01:29
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infatti,io vorrei scrivere qualcosa sui vettori.... pero'non si puo' scrivere qualcosa perche' c'e' tanto da dire,come anche sulle tecniche di clonaggio ,faresti prima a consultare un libro,come il DNA ricombinante oppure il libro di ingegneria genetica(Sandy Primrose,Richard Twiman)
Leonardo,la preghiera sara' fatta anche per chi ti da solo consigli?
se si ti ringrazio |
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Leonardo
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 21 novembre 2005 : 11:29:17
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Nico mi puoi illuminaresul protocollodelleultime tre tecniche?
grazie mille! |
"La felicità è come una farfalla:più cerchi di afferrarla più ti scappa.Trova il coraggio di star fermo e ti si poserà sulla spalla" |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2005 : 03:23:07
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Citazione:
2) A. Maggi - "Biotecnologie Farmacologiche", Masson
Ti sei dimenticato il sottotitolo : "una donna, un perche'"
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Le ultime 3 in realta' sono cose molto generali... non hai una domanda un po' piu' specifica?
Di blotting ne esistono molti tipi (southern blot, northern blot, western blot, slot blot, dot blot)...
In generale il blotting e' una tecnica che ti consiste nel far correre su un gel acidi nucleici (Southern x il DNA, Northern x l'RNA) o proteine (Western blot) e poi trasferirli su una membrana di nylon o nitrocellulosa.
Questa membrana puo' poi essere trattata con un anticorpo x le proteine o una sonda (vedi sotto) x DNA/RNA in modo da rilevare quello che stai cercando.
Check www.protocol-online.org x i protocolli
Per quanto riguarda le sonde sono corte (10-200bp) sequenze di DNA o RNA marcate in qualche modo (es. con nucleotidi radioattivi o coniugati a digossigenina etc) che ti servono x rilevare la presenza di altro DNA/RNA con sequenza complementare.
Ad es. su una membrana di un Southern hai molte sequenze di DNA. Vuoi vedere se il tuo gene X e' presente. Costruisci una sonda radioattiva con sequenza complementare a quella di X e la metti sulla membrana. La sonda ibridizzera' (terribile traduzione dell'inglese hybridise) cioe' si leghera' al suo complementare e quindi sulla membrana ti restera' della radioattivita' anche dopo aver lavato via l'eccesso di sonda. Puoi quindi mettere la membrana a contatto con una lastra fotografica e otterrai una bella foto con una banda dove la sonda si e' legata.
Per il clonaggio ti rimando ad AleXo... che lui fa quelle cosacce coi batteri... quando non incendia il lab! 
Scusa se non sono entrato troppo nei particolari, ma sono argomenti molto molto vasti e in questo periodo sono un po' preso...
nICO |
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lid
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2005 : 12:25:17
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scusate l'intrusione e soprattutto l'ignoranza, ma per inserire un tratto di DNA in un vettore è strettamente necessario usare lo stesso enzima di restrizione per tagliare vettore e tratto??? o ci sono dei compromessi...
ah un'altra cosa un enzima tipo EcorI che riconosce la sequenza GAATTC dove la taglia esattamente?? a metà??
grassie! |
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biotech
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
170 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2005 : 18:01:42
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No, se tu tagli con due enzimi che generano estremità adesive abbastanza compatibili, cioè che consentono alle due estremità di appaiarsi abbastanza bene puoi usare anche due enzimi differenti.
EcoRI se non erro taglia tra la G e le A; no non taglia a metà perchè è un enzima che dà estremità sporgenti non piatte, come darebbe un taglio del tipo che dici tu.
G
CTTAAG
se non erro EcoRI. |
http://boincstats.com/signature/user_1342603.gif |
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pasquale
Nuovo Arrivato
19 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2005 : 18:45:35
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Citazione:
ma per inserire un tratto di DNA in un vettore è strettamente necessario usare lo stesso enzima di restrizione per tagliare vettore e tratto??? o ci sono dei compromessi...
Come alternativa potresti tagliare vettore ed inserto con enzimi di restrizione diversi ma alla fine devi sempre riuscire ad avere le estremità dei due filamenti complementari aggiungendo linker (oligonucleotidi con all'interno un sito di restrizione di tuo interesse) o adapter(oligonucleotidi parzialmente sovrapponibili che appaiandosi andranno sempre a formare un sito di restrizione con estremità adesive). Se vuoi per capirlo meglio ti posso fare un esempio che a parole non é così semplice, ciao |
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lid
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2005 : 22:55:47
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grazie a pasquale e biotech, più che esaurienti, intanto ho notato che il vettore e la sequenza con cui ho a che fare presentano un sacco di siti per enzimi che tagliano blunt!!
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2005 : 04:16:16
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Chick purtroppo non ho la tua pazienza!
e ora come ora neanche tempo(sono anke le 3!!)
intanto ho trovato qualke link,
[sul clonaggio sono scritti manuali senza fine!]
http://www.molecularlab.it/clonaggio/index.asp
http://www.unifi.it/unifi/antrop/molecolare/pagine_molecolare/clonaggio.htm (si puà scaricare un ppt non male. abb semplice)
http://en.wikipedia.org/wiki/Recombinant_DNA_technology
http://en.wikipedia.org/wiki/Vector_DNA
http://en.wikipedia.org/wiki/Cloning
http://en.wikipedia.org/wiki/Subcloning
i wiki, inglese a parte, sono molto semplici e spero vadano bene...
il link lunghissimo che segue è il capitolo 7 (con tanto di figure) del Lodish,
lo trovo ben fatto: è abbastanza completo ma sintetico (il libro c'è anche in versione italiana) e soprattutto si trova online gratis!
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Search&db=books&doptcmdl=GenBookHL&term=recombinant+AND+mcb%5Bbook%5D+AND+105515%5Buid%5D&rid=mcb.section.1582
ecco il "summary":
* • In DNA cloning, recombinant DNA molecules are formed in vitro by inserting DNA fragments of interest into vector DNA molecules. The recombinant DNA molecules are then introduced into host cells, where they replicate, producing large numbers of recombinant DNA molecules that include the fragment of DNA originally linked to the vector.
* • The most commonly used cloning vectors are E. coli plasmids, small circular DNA molecules that include three functional regions: (1) an origin of replication, (2) a drug-resistance gene, and (3) a region where DNA can be inserted without interfering with plasmid replication or expression of the drug-resistance gene.
* • Two enzymes are used to produce recombinant plasmids. Restriction enzymes cut DNA at specific 4- to 8-bp sequences, often leaving self-complementary single-stranded tails (sticky ends). These enzymes are used to cut long DNA molecules into multiple restriction fragments and to cut a plasmid vector at a single site. If a restriction fragment and cut plasmid vector with complementary ends are mixed under the proper conditions, DNA ligase will form phosphodiester bonds between the restriction fragment and vector DNA (see Figure 7-7).
* • When recombinant plasmids are incubated with E. coli cells first treated with a high concentration of divalent cations, a very small fraction of the cells take up a single recombinant plasmid. These transformed cells, which carry the plasmid drug-resistance gene, can be selected by plating on nutrient agar containing the antibiotic (see Figure 7-3). All the cells in each colony that grows on this medium contain identical plasmids descended from the single plasmid that entered the founder cell of the colony. Isolated colonies thus represent clones of the different restriction fragments originally inserted into the plasmid vector.
* • Polylinkers are synthetic oligonucleotides composed of one copy of several different restriction sites. Plasmid vectors that contain a polylinker will be cut only once by multiple restriction enzymes, each acting at its own site. Inclusion of a polylinker in a plasmid vector thus permits cloning of restriction fragments generated by cleavage of DNA with multiple different restriction enzymes.
* • Single-stranded DNA containing up to 100 nucleotides of any desired sequence can be chemically synthesized using automated instruments. Synthetic dsDNAs are produced by synthesizing complementary ssDNAs and then hybridizing them.
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maia84
Nuovo Arrivato
43 Messaggi |
Inserito il - 29 dicembre 2005 : 20:49:55
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Citazione:
Messaggio inserito da Leonardo
cosa si significa che le basi azotate degli acidi nucleici sono altamente coniugate?
Forse che la adenina si lega con la timina e che la citosina con la guanina...PENSO... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 29 dicembre 2005 : 21:08:29
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Citazione:
Messaggio inserito da maia84
Forse che la adenina si lega con la timina e che la citosina con la guanina...PENSO...
No.... e' molto piu' semplice....
Un indizio? Chimica organica... doppi legami... |
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Shasa
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
Inserito il - 17 settembre 2007 : 15:22:38
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Se faccio il southern blot e uso una sonda specifica questa si appaierà solamente con la sequenza complemenare e mi aspetto di trovare una sola banda giusto? Ma se trovo più bande che significa?
grazie |
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ilarip
Utente Junior
Prov.: Bologna
Città: Bologna
432 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2007 : 15:52:48
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ciao shasa se trovi più bande significa che sei in una condizione di polimorfismo (ci sono differenze di taglio tra i 2 alleli)
ciao |
Ho imparato.. .che le opportunità non vanno mai perse.
Quelle che lasci andare tu...le prende qualcun altro
Ho imparato...che è meglio dare consigli solo in due circostanze...
Quando sono richiesti e quando ne dipende la vita.
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tommasomoro
Utente Junior
358 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2007 : 16:55:32
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TE sta per Tris-EDTA. E' una soluzione di 10 mM Tris-HCl pH 7.8 + 1 mM EDTA, tipicamente usata per dissolvere DNA/RNA (puoi usare anche acqua ma con il TE e' piu' stabile).
i kit qiagen usano buffer EB per la risospensione del DNA
EB buffer = 10 mM Tris-HCl non ricordo il pH
l'EDTA non viene usato perche' e' un agente chelante e potrebbe
interferire con eventuali/possibili reazioni successive in cui
utilizzerai il campione
di DNA
T. |
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Discussione |
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Aiuto per tecniche di biologia molecolare
Didattica
