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kiki
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
 Inserito il - 13 novembre 2007 : 19:04:30
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Ciao a tutti!avrei bisogno di capire una cosa che ho letto in 2 articoli: si tratta di identificare un polimorfismo con un enzima di restrizione. Nel primo articolo (di parecchi anni fa) riportano come è stato inizialmente studiato questo polimorfismo ovvero: (per semplicità chiamo i 2 alleli 1 e 2)
"Hanno prodotto un amplificato di 916 bp contenente il sito polimorfico e successivamente lo hanno tagliao con un enzima di restrizione. I prodotti del taglio (582 e 511 bp) sono stati poi analizzati su un gel di agarosio e si è visto che gli individui eterozigoti 1-2 erano caratterizzati dalla presenza di due bande: una di 582 bp e una di 511 bp; che gli individui omozigoti 2-2 presentavano solo la banda di 511 bp, mentre gli omozigoti 1-1 solo quella di 582 bp."
Nel secondo articolo più recente hanno analizzato lo stesso polimorfismo utilizzando lo stesso enzima di restrizione, però hanno fatto un'analisi in gel di acrilamide e hanno ottenuto questo:
(Hanno inoltre prodotto un amplificato più piccolo di 651 bp)
omozigoti 1-1 l'enzima taglia 3 volte generando 4 frammenti: 107,139, 158, 247 bp
omozigoti 2-2 l'enzima taglia 4 volte generando 5 frammenti: 71, 107, 158, 176
Quindi sostanzialmente il frammento di 247 bp in presenza del polimorfismo viene scomposto in 2 frammenti: 176 e 71 bp
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I punti esclamativi indicano i siti di taglio; l'ultimo indica il sito di restrizione in più creato dal polimorfismo.
Secondo me l'amplificato poteva essere ulteriormente ridotto di dimensioni in modo da ottenere meno frammenti.. perchè secondo voi hanno usato un amplificato così grande?
E secondo voi perchè non hanno utilizzato agarosio come nel primo studio, in modo da avere solo 2 bande?
Grazie!!
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Dorina
Nuovo Arrivato
Prov.: Monza
Città: Milano
30 Messaggi |
Inserito il - 13 novembre 2007 : 20:10:17
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| Salve, secondo me hanno utilizzato il gel di acrilammide perchè questo separa sequenze che si differiscono anche solo per un allele rispetto il gel di agarosio.poi non lo so perchè hanno utilizzato un amplificato di elevato dimensione. |
Dorina Qehajaj |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2007 : 01:13:09
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allora,
se ho capito bene
negli omozigoti 2-2 hai mancato la banda 139 bp
non vedo il perché nel primo lavoro la regione genomica abbia 1 sito di restrizione in quella zona, mentre nel secondo lavoro i siti di restrizione in quella stessa regione siano diventati 4 o 5.
Se parliamo di genomi sulla stessa specie animale, magari lo stesso ceppo e lo stesso polimorfismo (stessa regione) mi sembra un po' strano.
Detto questo, bisogna aggiungere che non puoi scegliere qualsiasi regione da amplificare, nel genoma alcune regioni sono difficili da utilizzare come target degli oligo.
La seconda ragione è che nella PCR su genoma possono uscire diversi amplificati non specifici, compresi oligo che si annilano tra loro e che danno delle bande strane che non derivano dal genoma, in pratica i frammenti al di sotto delle 200 basi che provengono dal genoma sono viste con sospetto. possono contenere contaminazioni di altro amplificato non specifico.
Nel primo lavoro lo screening non è ottimale poiché la differenza che vai a vedere è al limite della risoluzione del DNA su gel di agarosio, riconosci al massimo il 10% di differenza di peso molecolare, potresti avere difficoltà a riconoscerli differenze tra 580bp e 511bp (circa 12%) se il DNA non migra proprio bene non è facile riconoscere la differenza.
Nel secondo lavoro c'è il vantaggio di avere più bande dopo la digestione, quindi sei più sicuro della specificità del DNA, difficile trovare un qualsiasi frammento con quei siti di restrizione a quelle distanze, quindi potrebbe essere considerato un'impronta genetica il pattern.
Ovvio che nel secondo caso è meglio l'acrilammide che ha maglie più strette, ottimale per bande così piccole, e che discrimina fino alla differenza di una sola base tra due DNA, io ci facevo il controllo qualità di oligo di 20 bp e li discriminavo per la presenza di oligo a 19, 18 o 17 bp.
Il primo caso ha il vantaggio di discriminare tra omozigoti 1, omozigoti 2 ed eterozigoti 1-2 in modo facile ad occhio per semplice confronto.
Nel secondo caso c'è il vantaggio di essere maggiormente sicuri della specificità, però per l'interpretazione richiede qualche secondo in più per interpretare.
Le domande che fai sono lecite, ma tieni presente che dipende dalle disponibilità del laboratorio in questione, dal background culturale di chi fa l'esperimento e soprattutto dalla fortuna/sfortuna di trovare gli oligo giusti etc.
A volte lo stesso protocollo di PCR fatto su due macchine di PCR diverse o con Taq o buffers diversi possono dare diversa efficienza, quindi... quando trovi un protocollo per fare lo screening te lo tieni. 
Sei proprio sicuro che sia lo stesso polimorfismo, nella stessa regione genomica, sulla stessa specie animale?
Lo scopo era lo stesso? perché non ci sono gli stessi siti di restrizione?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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kiki
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2007 : 14:26:47
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| Scusate nell'omozigote 2-2 ho dimenticato di scrivere la banda da 139bp; comunque sì si tratta dello stesso polimorfismo studiato in uomo e con lo stesso enzima di restrizione..probabilmente un agarosio le altre bande che vengono prodotte sono piccole e vengono perse |
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Ayla
Utente Junior
Città: Wageningen
573 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2007 : 16:48:08
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Ma in acrilammide dovresti comunque vedere le bande a 511 e 587, no?
poi 247bp non é piccolo per l'agarosio... volendo riesci a vedere anche bande di 20bp... |
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kiki
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 15 novembre 2007 : 10:04:24
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| Come ho scritto però nei 2 articoli partono da un amplificato di dimensioni diverse: nel primo caso 916 bp, nel secondo caso 651 bp |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 15 novembre 2007 : 23:04:09
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Kiki,
il fatto strano è che una regione di 916 dovrebbe verosimilmente contenere anche una buona parte della regione 651 poiché seguendo un filo logico...
la PCR di 916 contine il polimorfismo al centro del prodotto di PCR, quindi ci sono circa 500-600 bp da un lato o dall'altro, ed in questa regione esiste 1 solo sito di restrizione....
la seconda PCR, che contiene ancora lo stesso polimorfismo e che è di sole 600 basi... deve necessariamente essere una sottoregione della prima PCR
|--------------x-------------| PCR di 916 bp (x è il polimofismo)
|---------x---| di circa 600 bp (x è il polimorfismo)
la domanda è: come è possibile che nella prima PCR (regione più grande) ci sia un unico sito di restrizione, mentre in una sua sottoregione di 600 bp ce ne sono addirittura 4?
Ripeto: sei sicuro che si tratti dello stesso polimorfismo, nella stessa regione, nello stesso DNA genomico etc etc etc?
magari ci puoi dare gli estremi di questi due articoli oppure le sequenze dei primers che hanno utilizzato per amplificare le due regioni?
qualcosa non mi quadra
P.S.: il motivo dell'acrilamide è banale; è vero come ha detto Ayla che su un gel di agarosio vedi persino i primers di 20 bp, però si vedono molto male, le bande di basso peso molecolare spesso si denaturano durante la migrazione se le diluite in acqua senza TE e poi di disperdono un po' nel gel di agarosio... insomma alla fine la banda è una sfumatura spesso anche storta... provate a guardare su gel di acrilamide il DNA anche di sole 20 bp... la banda è sottile, precisa e netta come una lama di coltello. Fino a 200 bp l'acrilamide non teme confronti con il gel di agarosio.
Però dipende anche da che cosa hai in lab (l'acrilamide richiede delle camerette dedicate che bisogna avere e molta più accuratezza per il maneggiamento) e da quanta risoluzione ti serve per il tuo esame.
Quando l'ho usato io dovevo vedere differenze di 1 sola base su oligo di circa 120 bp per valutare la percentuale di oligo incompleti che contaminavano la mia soluzione. Diverso invece quello che ho fatto nei giorni scorsi dove dovevo valutare se si è staccato o no un frammentino di 13 basi da un oligo di 80 bp... l'agarosio per questo basta e avanza.
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kiki
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2007 : 21:36:31
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| appena riesco a recuperare l'articolo vi do la referenza, grazie mille intanto |
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