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noa84
Nuovo Arrivato
Prov.: Messina
23 Messaggi |
 Inserito il - 16 dicembre 2007 : 16:12:26
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quali sono i passaggi della western blot?
la differenza con la southern è solo che ad essere saggiate sono le proteine e non il dna e che non si usa una sonda ma un anticorpo???
 
Spero che qualcuno possa chiarire i miei atroci dubbi!!
grazie
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2007 : 17:41:16
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| Detto in due parole...Il gel delle proteine è verticale e le proteine non vengono passate sul foglio di nitrocellulosa per capillarità ma vengono traferite con una differenza di potenziale come avviene per la corsa...Il sandwich si prepara in uno strumentino apposito che poi viene messo in una cella apposita per il trasferimento, per il southern invece fai tutto sul gel...Per rivelare il trasferimento colori nel western il foglio con ad es. Rosso Ponceaux e per trovare la proteina di tuo interesse dopo aver decolorato devi saturare prima la membrana con una proteina standard, ad es. BSA, per evitare che l'Ab primario si leghi aspecificamente alla membrana e poi devi incubare con un Ab primario che riconoscerà un epitopo della proteina di tuo interesse...Per rivelare se il complesso Ab-proteina si è formato devi incubare con un Ab secondario che riconosce l'Fc dell'Ab primario, e questo secondario sarà marcato in qualche modo (biotinilato, coniugato con perossidasi, caldo, ecc...) in modo da poter vedere se lì c'è la proteina che cerchi e dove sta...Nel Southern tutti questi passaggi non sono necessari perché incubi direttamente la membrana con una sonda radioattiva che verrà rivelata mediante autoradiografia... |
 
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Biotecnologo1987
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: teramo
100 Messaggi |
Inserito il - 24 dicembre 2007 : 18:59:23
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1) Fasi di una Western Blot:
#61656; SDS-PAGE
#61656; BLOTTING (trasferimento di proteine su membrana)
#61656; BLOCKING (saturazione siti aspecifici della membrana con latte)
#61656; Incubazione con ANTICORPO I
#61656; Incubazione ANTICORPO II (coniugato con tracciante)
#61656; DETECTION (rilevazione)
…::: BLOTTING :::…
Questa fase consiste nel trasferimento delle proteine dal gel dell’SDS-PAGE (catodo) ad una membrana di nitrocellulosa o PoliViniliDenFluoruro (anodo). La membrana viene posizionata secondo un ordine ben preciso così da formare il cosiddetto sandwich, che viene impilato in una cassettina avente la funzione solamente di supporto rigido.
Dal catodo si avrà:
Rettangolo di spugna
#61609; 2 fogli di carta assorbente delle stesse dimensioni della spugna
#61609; Gel senza lo SG
#61609; Membrana
#61609; 2 fogli di carta assorbente delle stesse dimensioni della spugna
#61609; Rettangolo di spugna
Prima di tutto si deve preparare il tampone di trasferimento dove immergeremo singolarmente i costituenti del sandwich per 5’ al fine di equilibrarli mentre la membrana viene equilibrata in H2O bd per lo stesso tempo.
Il tampone, grazie alla sua capillarità, attraversa la carta assorbente ed è come se spingesse le proteine dal gel alla membrana.
Il buffer di trasferimento è costituito da:
#61609; 25 mM Trizma (MW=121.14)
#61609; 0.2 mM Gly (MW=75.07)
#61609; 20% metanolo pH 8.5
Si deve calcolare la quantità in g del Trizma e della Gly tramite la formula inversa della M quindi M = n / Vf quindi n = M * Vf da cui n = g / MW quindi g = MW*n:
#61609; Trizma 25 mM = 3.0285 g
#61609; Gly 0.2 mM = 0.0150 g
#61609; Metanolo 200 ml / L
Una volta equilibrati i costituenti si dovrà montare il sandwich e posizionarlo all’interno della cameretta elettroforetica facendo attenzione a rispettare le polarità collegando gli elettrodi in modo adeguato (la membrana deve essere rivolta verso l’anodo rosso) ed impostando il voltaggio costante a 50 V (per proteine fino a 60 kDa 2 ore, per quelle sopra i 100 kDa 12 ore).
Trascorso questo tempo, si deve trasferire la membrana in una Petri verificando la presenza del marker di MW sulla stessa che confermerà l’avvenuto trasferimento delle proteine e nel frattempo versare 10 ml di soluzione Rosso Ponceau per 5’che può essere riciclato più volte (0.1 ml di colorante ogni 1 ml di acido acetico) avendo cura di drenare il colorante e decolorare con H2O bd fino a quando non siano visibili le bande. Questo passaggio serve per verificare l’efficienza del trasferimento cioè mostrare le eventuali bolle d’aria e l’area di lavoro in base alle esigenze.
…::: BLOCKING :::…
La fase di Blocking è molto importante perché permette la saturazione della maggiorparte dei siti aspecifici proteici presenti sulla membrana comportando una diminuzione del background (i siti aspecifici futili sono interferenze).
Per eseguire questa operazione si deve preparare la soluzione di blocking (50 ml + 2.5 g di latte) costituita da TBST + 5% di latte non grasso in polvere (perché i lipidi presenti in quello intero alterano la composizione della membrana).
La soluzione TBST deriva dalla TBS 10x cioè la soluzione di lavaggio concentrata 10 volte; viene così preparata:
#61609; 87.66 g NaCl
#61609; 24.22 g Trisma
Disciolti in 800 ml di H2O bd aggiustando il pH a 7.4 con HCl
Ora bisogna preparare la TBST che verrà utilizzata in parte per la blocking e in parte per i lavaggi della membrana:
TBST (250 ml):
Siccome la TBS 1x è diluita 10 volte bisogna fare 250 ml / 10 = 25 ml da prelevare dalla TBS 10x. A questi 25 ml aggiungiamo lo 0.05% di Tween-20 (0.05 ml ogni 100 ml quindi 0.125 ml cioè 125 µl), un detergente non ionico portando a volume con H2O bd.
Preparate queste soluzioni si deve incubare per 30’, T ambiente e sotto agitazione la membrana al fine di compiere la fase di Blocking, drenando infine il latte in eccesso e lavando con la TBST per 3-4 volte.
Diluizione e Incubazione con Ab I e Ab II:
Bisogna chiarire che questo è un metodo che sfrutta la marcatura con anticorpi in modo indiretto cioè l’ Ab I è l’antigene dell’ Ab II che rivela la reazione o tramite chemiluminescenza (luminolo su pellicola) o tramite segnali colorimetrici (come in questo caso con la DAB). L’Ab II può essere coniugato inoltre ad isotopi radioattivi come lo I125 , a fluorofori (fluoresceina, rodamina) oppure alla Biotina (vitamina idrosolubile). Viene utilizzata la marcatura indiretta semplicemente perché è molto più sensibile rispetto a quella diretta.
Da specificare che entrambi gli Ab devono essere sia POLICLONALI cioè derivanti da più plasmacellule, sia provenienti da organismi diversi al fine di riconoscerli come non-self e permettere il loro legame es:
#61609; Ab I di coniglio Ab II deve essere anti-rabbit (cavallo ecc)
Per preparare la soluzione dell’Ab I si prelevano 5 ml di Blocking versandoli in una provetta pulita ed aggiungendo 10 µl di Ab policlonale I cioè l’anti-actina per sensibilizzare la reazione, versando il tutto nella Petri contenente la membrana lavata; si mette in agitazione per 1h e si prepara all’incubazione dell’Ab II drenando l’Ab I e lavando con la TBST.
Adesso si deve incubare la membrana con l’Ab II (amplifica la reazione), coniugato ad un enzima chiamato perossidasi: È un enzima che appartiene alla classe delle reazioni redox, cioè che catalizza l’ossidazione di un substrato rimuovendo due atomi di H che vengono ad ossidarsi con 2 molecole di acqua ossigenata. In questo caso il substrato cromogeno è la 3,3-DiAminoBenzidina (DAB) che da luogo alla formazione di un precipitato marrone rendendo possibile la visualizzazione della sola proteina in esame.
Per preparare invece la soluzione dell’Ab II (1:1000) si prelevano 5 ml di Blocking quindi 1000:1 = 5000 µl: x; quindi x = 5µl di Ab II incubandolo anch’esso per 1h e poi effettuare i lavaggi consueti.
Durante il periodo dell’incubazione viene preparata la soluzione DAB che permetterà la reazione:
Viene ridotto a DAB (ridotto) e H2O2 viene ossidata a 2 H2O formando un prodotto sul giallo scuro-marrone insolubile in alcool e renderà visibile la proteina in esame.
QUESTA è PARTE DELLA MIA TESINA...FANNE BUON USO...GRAZIE... |
Davide* |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 24 dicembre 2007 : 21:01:59
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In un recente topic qualcuno aveva inserito una immagine molto esplicativa... ma non riesco più a trovarlo...
Se cerchi nei messaggi recenti magari avrai più fortuna! |
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