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Discussione |
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Creatura
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 14 gennaio 2008 : 17:34:10
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Salve, qualcuno potrebbe illuminarmi sulla ricerca di un promotore per esprimere in grande quantità un gene specifico?
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2008 : 20:04:14
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| cosa intendi?ci sono specifici vettori per esprimere in grandi quantità le seq inserite come ad es i vettori d'espressione.. |
Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
errore di stampa... |
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Creatura
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2008 : 22:32:57
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Io ho un vettore che contiene il mio gene specifico, ma a monte ci devo inserire un promotore che permetta di avere un'elevata espressione del mio gene.
Citazione:
Messaggio inserito da nyo84
cosa intendi?ci sono specifici vettori per esprimere in grandi quantità le seq inserite come ad es i vettori d'espressione..
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Nick_row
Utente Junior
361 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2008 : 23:38:56
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| il promotore del cmv,ottimo in questi casi! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2008 : 23:51:52
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Innanzitutto: devi esprimere in batteri o in cellule eucariotiche?
pCMV è ottimo per cellule eucariotiche, ma per cellule batteriche ti occorrerà un T7 |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2008 : 03:52:49
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| Comunque anche in cellule eucariotiche non è detto che il CMV sia sempre la scelta migliore, in quanto ha alta efficacia in alcune cellule ma bassa in altre |
Sei un nuovo arrivato?
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Nick_row
Utente Junior
361 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2008 : 07:37:07
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| ovvio,la mia era un'indicazione generale,non sapendo in che cellule deve operare... |
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Creatura
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2008 : 08:50:18
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Il vettore opera in cellule eucariotiche...tuttavia ho già provato con il promotore di CMV ma il livello di espressione è cmq troppo basso....devo trovarne un altro...
Citazione:
Messaggio inserito da Nick_row
ovvio,la mia era un'indicazione generale,non sapendo in che cellule deve operare...
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RNA world
Utente Junior
370 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2008 : 10:25:15
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| la bassa espressione non è sempre dovuta al promotore, ma anche dal tipo di proteina che devi esprimere. di cosa si tratta? |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2008 : 18:12:40
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Concordo anche io
dovresti dire almeno che livello di espressione ti serve, oppure il tipo cellulare in cui farai l'espressione.
Io conosco il promotore di large T SV40, CMV, Tirosin Kinasi e l'albumina sierica bovina. Altri sono un po' più rari poiché troppo forti o troppo deboli.
Se vuoi avere un livello di espressione più alto potresti considerare anche diversi altri punti
1) aggiungere un enancher
2) inserire un segnale di polyA più forte o migliore
3) aggiungere o sostituire la 5' e 3' UTR importantissime per la stabilità dell'mRNA
4) aggiungere un introne poco prima del cDNA, aumenta notevolmente la stabilità dell'RNA e di conseguenza l'espressione proteica
5) cambiare la kozak in una più forte
6) cambiare i codoni in una serie più affine alla cellula in cui inserisci il DNA.
7) legare la tua proteina a qualcosa che ne aumenti la solubilità
8) mettere più copie del tuo cDNA
i primi 5 punti spesso sono ignorati, ma fondamentali per avere un buon grado di espressione.
in bocca al lupo
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Creatura
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2008 : 22:44:37
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Si tratta del gene BFL1, è un gene che esprime una proteina anti-apoptotica...
Citazione:
Messaggio inserito da RNA world
la bassa espressione non è sempre dovuta al promotore, ma anche dal tipo di proteina che devi esprimere. di cosa si tratta?
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 28 gennaio 2008 : 22:19:54
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Se il costrutto è buono (conrollato? sequenziato?) e l'espressione
non va, potrebbe trattarsi di un problema a livello del trascritto
(fai una RT-PCR per escluderlo) oppure a livello del rapporto tra
la proteina e la cellula, ad es. problemi di folding si possono
escludere testando l'attività biologica (se è testabile) contro
un riconoscimento in western con Ab specifici per la forma lineare
(oppure, più spesso contro un tag lineare: ad es. HA, Myc o poly-His).
Direi che il problema della forza del promotore (gran gatta
da pelare) va posposto rispetto a tutti questi accorgimenti. no? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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