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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
 Inserito il - 15 aprile 2008 : 16:15:05
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Il sistema pET è un sistema di espressione. cioè viene usato per fare esprimere un determinato gene in una cellula ospite. il sistema si avvale di un vettore che serve a produrre la proteina di interesse e perciò il vettore deve portare nella sua sequenza un promotore appropriato (la scelta del promotore è legata fortemente dal gene che devi trasdurre. se ti occorre ad esempio un'espressione costitutiva o inducibile adopererai due diversi promotori, ancora di più se vuoi un'espressione massiccia, allora userai un promotore forte, come per esepio il promotore del CMV, insomma, sulla scelta dei promotori se ne può dire molto). logicamente il vettore deve portare anche un sito di inizio e fine trascrizione, un RBS (che è il ribosome binding site) o, in alternativa, un IRES che è sempre una sequenza di legame per il ribosoma, ma interna, cioè contenuta tra due geni (questo nel caso in cui hai due diversi geni da far esprimere contemporaneamente, ad esempio, un gene X di interesse specifico e un gene reporter per il monitoraggio).
questo è in linea di massima il concetto di sistema di espressione. nello specifico, il sistema pET è un plasmide usato per veicolare geni e produrre poroteine in un batterio. il plasmide porta i geni dell'operone lac(servono a regolare la trascrizione, ti consiglio di rivedere il sistema perchè non è semplicissimo), il promotore che in questo caso è specifico per l'RNA polimerasi T7 (quindi non è un promotore per il gene della polimerasi batterica che è la tua cellula ospite), poi c'è l'origine di replicazione ed altri geni. questa è un'immagine schematica di pET. vedi che c'è f1 (l'origine di replicazione), i geni del sistema lac, un gene di selezione positiva ampR e così via.
Immagine:
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questa è più bella ma anche più difficile ed è molto più dettagliata.
Immagine:
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il gene che vuoi far esprimere è stato clonato nel plasmide (si trova nel sito pLink che vedi nella I immagine). la polimerasi T7 può trascrivere il gene riconoscendo il promotore T7, che è un promotore virale molto forte, come il promotore del CMV e quindi viene fatta tanta proteina. naturalmente, il tuo gene non verrà trascritto se non c'è la polimersi T7, la quale non è prodotta dalle cellule procariotiche e quindi per far funzionare il sistema è molto importante che all'ospite venga fornita anche questa polimerasi. (cioè, fornisci il gene della polimerasi).
il vantaggio del sitema è che puoi controllare l'espressione del gene e per fare questo usi il sitema lac incorporato nel plasmide pET.
per questo è importante, come ti dicevo, sapere come funziona il sistema lac.
mentre cercavo delle immagine del plasmide, ho trovato aanche questo che magari può aiutarti:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=48
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=5436
http://it.wikipedia.org/wiki/Operone (scorrendo trovi l'operone lac)
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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