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vale1
Utente Junior
179 Messaggi |
 Inserito il - 12 gennaio 2006 : 17:04:02
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Salve a tutti! devo fare una tesina in cui descrivere in generale il protein de novo design, per favore qualcuno saprebbe dirmi qualcosa di generale e introduttivo sul protein de novo design? mi andrebbe bene anche qualche sito da cui prendere info! grazie
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 12 gennaio 2006 : 19:35:19
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argomento stupendo!!!!!!!!!!
Secondo me il modo migliore cercare qualche review in pubmed (ho provato con " protein novo design", ed escono fuori risultati interessanti secondo me!).
prova anche a dare un occhio qui: http://www.princeton.edu/~hecht/research.html
Sarei molto curioso di leggere il tuo lavoro... |
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vale1
Utente Junior
179 Messaggi |
Inserito il - 13 gennaio 2006 : 18:41:45
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grazie per le info! quando finisco il lavoro te lo mando |
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vale1
Utente Junior
179 Messaggi |
Inserito il - 28 gennaio 2006 : 16:22:48
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Citazione:
Messaggio inserito da AleXo
argomento stupendo!!!!!!!!!!
Secondo me il modo migliore #143; cercare qualche review in pubmed (ho provato con " protein novo design", ed escono fuori risultati interessanti secondo me!).
prova anche a dare un occhio qui: http://www.princeton.edu/~hecht/research.html
Sarei molto curioso di leggere il tuo lavoro...
eccoti accontentato! 
Il protein de novo design rappresenta una delle strategie che costituiscono il ¡°protein engineering¡±, ovvero quell¡¯insieme di tecniche di ingegneria proteica che mirano a studiare le proteine al fine di caratterizzarle strutturalmente e funzionalmente e che hanno come obiettivo ultimo la costruzione di molecole proteiche ricombinanti.
Il protein de novo design ¨¨ un approccio che permette di disegnare e costruire proteine sintetiche dotate di propriet¨¤ funzionali nuove o modificate e rappresenta pertanto una metodologia che aiuta a comprendere i principi che governano l¡¯organizzazione struttura/funzione delle proteine e, soprattutto, di costruire delle proteine nuove che trovano applicazione principalmente in campo medico, industriale, farmaceutico e biotecnologico.
Per disegnare la proteina di interesse ¨¨ necessario individuare la sequenza amminoacidica in grado di foldare in una struttura tridimensionale adeguata che rappresenta il target e che corrisponde ad un minimo energetico. A tal proposito ¨¨ interessante notare che le tecniche di design presentano il problema inverso rispetto alle strategie di predizione di strutture proteiche: in quest¡¯ultimo caso si cerca di costruire il modello di una struttura proteica tridimensionale a partire dalla struttura primaria, mentre, nel caso delle strategie di design, si mira alla ricerca della sequenza amminoacidica corrispondente alla conformazione pi¨´ stabile di una struttura terziaria prefissata e definita. Il problema del folding delle proteine gioca pertanto un ruolo centrale nell¡¯ingegnerizzazione e nel disegno de novo di proteine in quanto per poter disegnare, progettare e costruire una proteina ¨¨ naturalmente necessario possedere ottime conoscenze sui principi che governano il folding, ovvero sui meccanismi che guidano l¡¯acquisizione della struttura tridimensionale di una proteina consentendole di svolgere l¡¯attivit¨¤ biologica.
Nononostante i progressi tecnologici, non ¨¨ stato fino ad ora possibile elucidare in modo esaustivo i meccanismi di folding mediante metodi sperimentali, per cui metodi teorici e computazionali (per es. i metodi ab initio, fold recognition, homology modeling e dinamica molecolare) sono largamente impiegati per cercare di comprendere il folding e riuscire cos¨¬ a prevedere le strutture terziarie di proteine. Inoltre, per il design di proteine vengono ampiamente sfruttati dei programmi di grafica in grado di elaborare la rappresentazione grafica del modello 3D di una proteina a partire dalle sue coordinate cartesiane. E¡¯ possibile in tal modo verificare l¡¯effetto di sostituzioni amminoacidiche sulla struttura, poich¨¦ le catene laterali degli amminoacidi possono essere considerate come un set discreto di rotameri che, se opportunamente manipolati, possono dar luogo a nuove sequenze e quindi a nuove strutture d¡¯interesse.
Uno dei primissimi approcci al protein de novo design ¨¨ rappresentato da uno studio1 condotto sull¡¯RNAsi A pancreatica bovina modificata chimicamente dall¡¯aggiunta di un cross-linkante (dinitrofenilene, DNP) che lega covalentemente il gruppo amminico ¦Å delle Lys in posizione 7 e 41.
Sebbene studi di cristallografia ai raggi X abbiano evidenziato che l¡¯organizzazione strutturale di base resti inalterata, la proteina cross-linkata denatura ad una temperatura di circa 25¡ãC superiore rispetto a quella dell¡¯enzima originale sotto le stesse condizioni. Questa differenza di stabilit¨¤ termica potrebbe essere dovuta ad una riduzione dell¡¯entropia conformazionale che caratterizza e destabilizza lo stato unfoldato della proteina cross-linkata.
Nonostante i progressi che hanno caratterizzato il de novo design negli ultimi anni, risulta ancora difficile disegnare proteine che foldino in una struttura tridimensionale predeterminata. Inoltre si deve considerare che ogni peptide, poich¨¦ costituito da 20 amminoacidi diversi, pu¨° assumere in acqua un vasto range di stati conformazionali e assumere una conformazione ben definita solo quando ¨¨ complessato a ioni metallici, ad altre molecole e/o proteine. Pertanto, una delle necessit¨¤ del de novo design consiste nel provocare una diminuzione della flessibilit¨¤ del peptide introducendo delle costrizioni conformazionali. Ci¨° pu¨° essere perseguito inducendo l¡¯oligomerizzazione di un singolo peptide che, da solo, non pu¨° assumere una conformazione davvero stabile, mentre nella forma oligomerica viene stabilizzato da interazioni a lungo raggio che si vengono a creare tra specifici residui appartenenti ai peptidi adiacenti. La costruzione di questi oligomeri-framework e la combinazione migliore di questi con gli opportuni gruppi funzionali, permette di raggiungere la funzione biologica prefissata.
Per la sua semplicit¨¤ e regolarit¨¤, il motivo ¦Á-elica coiled-coil ¨¨ il pi¨´ utilizzato per chiarire le interazioni molecolari responsabili del folding e della stabilit¨¤ delle proteine: esso rappresenta, infatti, uno dei pi¨´ comuni motivi di oligomerizzazione poich¨¦ caratteristico di molte proteine oligomeriche i cui monomeri sono capaci di assumere in maniera autonoma specifiche conformazioni di folding e di interagire tra loro grazie proprio alla presenza di tali domini.
Il motivo coiled-coil ¨¨ costituito generalmente da 2 ¦Á-eliche anfipatiche destrorse che si avvolgono l¡¯una sull¡¯altra a formare una struttura sinistrorsa. Le sequenze amminoacidiche delle proteine a struttura ¦Á-elica coiled-coil parallela sono caratterizzate inoltre da un pattern ripetuto di 7 amminoacidi (a, b,...g/ a¡¯, b¡¯,¡g¡¯) caratterizzato da residui apolari (o idrofobici) in posizione a e d (¡°knobs into holes¡±); a livello delle catene laterali di questi ultimi due si verifica un¡¯interazione di natura idrofobica che, insieme ai ponti salini presenti, stabilizza la struttura.
Questo tipo di approccio ¨¨ stato sfruttato da alcuni ricercatori2 che hanno costruito il pi¨´ corto peptide realizzabile a struttura coiled-coil per ottenere un sistema modello utile allo studio dei contributi energetici apportati dalle interazioni a corto e a lungo raggio.
Per disegnare il peptide d¡¯interesse ¨¨ necessario conoscere i fattori che stabilizzano l¡¯¦Á-elica monomerica (interazioni a corto raggio) e quelli che invece stabilizzano ¦Á-elica oligomerica (interazioni a lungo raggio).
Le interazioni a corto raggio sono principalmente rappresentate da:
- presenza di residui ad alta propensit¨¤ di formare struttura ad ¦Á-elica
- ponti salini intraelica (i... i+3 principalmente Glu-Arg; i¡ i+4 principalmente Arg-Glu)
- motivi di capping ottimali (come la succinilazione)
- cariche negative all¡¯N-terminale e cariche positive al C-terminale
- utilizzo preferenziale di Arg al posto di Lys
I fattori che contribuiscono alla stabilit¨¤ dell¡¯¦Á-elica oligomerica sono:
- interazioni idrofobiche
- presenza di Ile in posizione a e di Leu in posizione d
- ponti salini interelica
I ricercatori, basandosi sui principi che regolano il protein de novo design, hanno progettato un peptide costituito da una struttura coiled-coil parallela e di lunghezza pari all¡¯eptade amminoacidica ripetuta: Succ-Asp-Glu-Leu-Glu-Arg-Arg-Ile-Arg-Glu-Leu-Glu-Ala-Arg-Ile-Lys
a b c d e f g a¡¯ b¡¯ c¡¯ d¡¯ e¡¯ f ¡® g ¡®
Mediante le tecniche del dicroismo circolare e dell¡¯ultracentrifugazione analitica ¨¨ stato possibile confermare che il peptide ¨¨ effettivamente strutturato in ¦Á-elica e che la presenza del motivo coiled-coil di 7 amminoacidi ripetuto due volte rende possibile al 100% la forma dimerica in condizioni fisiologiche.
La correttezza dei principi su cui si ¨¨ basato il design sono stati poi verificati per cristallografia ai raggi X: la struttura del peptide non risulta essere un molten-globule (indice di struttura unfoldata) bens¨¬ assume un¡¯unica struttura nativa.
Lo stesso gruppo di ricerca ha successivamente approfondito questo tipo di studio3 estendendo la tecnica del de novo design ad altri quattro tipi di peptidi costruiti in modo tale da presentare struttura analoga a quella del peptide parentale prima discusso ma caratterizzata da un diverso tipo di interazioni ioniche inter- ed intra-elica, al fine di determinarne il contributo nella stabilizzazione della stessa struttura coiled-coil.
Tale contributo ¨¨ stato analizzato per dicroismo circolare e ultracentrifugazione differenziale: tutti e quattro i peptidi sono strutturati principalmente in ¦Á-elica, tuttavia solo due di essi si trovano in forma dimerica al 100% in condizioni fisiologiche poich¨¦ solo in due dei quattro peptidi l¡¯oligomero viene stabilizzato dalla presenza di ponti salini inter-elica energeticamente pi¨´ favorevoli.
Il peptide pi¨´ stabile dei quattro ¨¨ stato poi confrontato con il peptide parentale per cristallografia ai raggi X. Dal confronto delle due strutture risulta evidente che combinando le interazioni ioniche inter- ed intra-elica pi¨´ favorevoli ¨¨ possibile disegnare domini coiled-coil di oligomerizzazione dotati di una maggiore stabilit¨¤ rispetto al peptide di partenza; inoltre i peptidi disegnati e costruiti presentano notevoli vantaggi in quanto rappresentano un sistema modello per lo studio e la comprensione dei fattori responsabili del folding e della stabilit¨¤ e possono essere utilizzati per disegnare semplici motivi di riconoscimento molecolare, come sistemi bersaglio nell¡¯azione di farmaci/droghe o per la progettazione di biosensori.
Il passo successivo4 ¨¨ stato quello di alterare alcuni amminoacidi implicati nella formazione dei ponti salini per andare a studiare l¡¯effetto che si produce nella struttura.
I ricercatori hanno effettuato il de novo design del motivo coiled-coil di 7 amminoacidi ripetuto due volte andando a sostituire gli amminoacidi in posizione g ed e¡¯ (ponte salino inter-elica RE, ovvero, rispettivamente, Arg-Glu) con una Alanina la quale presenta una maggiore propensit¨¤ a formare strutture di tipo ¦Á-elica.
Esperimenti di CD e cristallografia ai raggi X hanno dimostrato che il peptide disegnato in questo modo, come predetto, non ¨¨ pi¨´ in grado di costituire una struttura coiled-coil parallela, bens¨¬ diventa un assemblato globulare ottamerico strutturato in ¦Á-elica in cui non sono riscontrabili le tipiche interazioni di tipo coiled-coil a causa dell¡¯assenza del ponte salino g-e¡¯ RE.
Un altro esempio di protein de novo design ¨¨ l¡¯ingegnerizzazione delle conotossine (CTXs)5.
Esse sono ottenute da alcune specie di lumache marine e possono essere letali, poich¨¦ bloccano la trasmissione dell¡¯impulso nervoso dal nervo al muscolo nella giunzione neuromuscolare.
Le conotossine possono essere sintetizzate chimicamente come corti peptidi di 15-40 amminoacidi compattati dalla presenza di molteplici ponti disolfuro che ne permettono la distinzione in varie classi. Le CTXs possono essere utilizzate come ¡°farmaci guida¡±, tuttavia le possibili applicazioni terapeutiche sono limitate dalla suscettibilit¨¤ che esse presentano verso la proteolisi in vivo.
Per ovviare a questo problema si ¨¨ pensato di ciclizzare le ¦Á-CTX MII (tipo di CTXs antagonisti del ligando peptidico del recettore nicotinico ad acetilcolina) cos¨¬ da ottenere un peptide ingegnerizzato che conservi la piena attivit¨¤ ma che presenti una maggior resistenza alla degradazione proteolitica. La costruzione della forma peptidica ciclica ¨¨ permessa da un range di linkers in grado di legare le estremit¨¤ N- e C-terminali della proteina in questione. In questo modo sono stati disegnati e costruiti tre diversi tipi di analoghi a struttura ciclica, cMII5, cMII6 e cMII7, che presentano, rispettivamente, un linker costituito da 5, 6 o 7 residui amminoacidici capaci di legare le due estremit¨¤ della proteina ciclizzandola.
I peptidi cMII6 e cMII7 presentano un¡¯attivit¨¤ paragonabile a quella del peptide naturale ed una resistenza alla proteasi EndoGluC molto maggiore, risultando quindi molto pi¨´ stabili.
Questi studi dimostrano che la ciclizzazione del backbone migliora la stabilit¨¤ della tossina peptidica e lascia inalterata l¡¯attivit¨¤ biologica.
Le strategie di ciclizzazione rappresentano un efficace approccio per stabilizzare peptidi bioattivi al fine di renderli impiegabili come farmaci guida nel campo medico.
Referenze
1. P.C. Weber et al. (1985). The 2-#506; resolution structure of a thermostable Ribonuclease A chemically cross-linked between lysine residues 7 and 41
2. P. Burkhard et al. (2000). Design of a minimal protein oligomerization domain by a structural approach
3. P. Burkhard et al. (2002). Improving coiled-coil stability by optimizing ionic interactions
4. P. Burkhard et al. (2002). Removing an interhelical salt bridge abolishes coiled-coil formation in a de novo designed peptide
5. R. J. Clark et al. (2005). Engineering stable peptide toxins by means of backbone cyclization: stabilization of the ¦Á-conotoxin MII
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