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annamaria_mi
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: milano
18 Messaggi |
 Inserito il - 07 aprile 2008 : 15:44:11
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ragazzi ho bisogno di voi, qlc fa western blot sulla componente bianca del sangue? sapreste darmi suggerimenti, aiuti o protocolli su come procedere una volta estratto il sangue (in teoria da topo). a quanto deve essere fatta la centrifugata per separare componente rossa da quella bianca? che buffer di lisi utilizzate per estrarre proteine citoplasmatiche dalle cellule del sangue? il dosaggio si riesce a fare o è un passaggio da saltare per evitare complicazioni? e per il resto si procede come un normale western? fino ad ora ho lavorato solo su campioni di linee cellulari..quindi non saprei da dove partire!!
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bepo
Nuovo Arrivato
Città: novara
30 Messaggi |
 Inserito il - 07 aprile 2008 : 19:00:14
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ciao! per separare i linfociti o PBMC(cellule polimorfonucleate di sangue periferico), uso la metodica di separazione "Fycol",uso questa sostanza che è uno zucchero, per creare (tramite centrifugazione)un gradiente di densità. in questo modo si creano delle bande (rappresent da globuli rossi che precipitano sul fondo della provetta, l'anello di linfociti, plasma e siero). una volta recuperato l'anello ( i linfociti) faccio due lavaggi veloci in PBS1x e generalmente il pellet lo congelo a -80 per estrarne proteine e procedere con un normale western. dopo lisi (uso il buffer AKT, purtropp non ricordo la ricetta, non sono piu in labo..)quantizzo le proteine con BIOrad e generalmente non ho problemi. spero di esserti stato utile e se ti interessano mggiori dettagli, chiedimeli pure.ciao! |
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Biotecnologo1987
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: teramo
100 Messaggi |
Inserito il - 08 aprile 2008 : 12:25:37
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| se ti interessano le cellule mononucleate del sangue(monociti, granulociti ecc) puoi ricorrere al terreno Histopaque della sigma-tau-... |
Davide* |
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annamaria_mi
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: milano
18 Messaggi |
Inserito il - 14 aprile 2008 : 11:40:02
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| ok grazie mille..una cosa..il ficoll deve essere necessariamente hystopaque?io in labo ho un ficoll w.t.400, posso usare quello? in che concentrazione e come? hai un protocollo preciso? nel senso..sapresti dirmi la centrifugata a quanto la fai e a che T?secondo te l'anello di leucociti a quel punto è utilizzabile anche per mettere le cellule su vetrino e procedere con un immunofluorescenza? |
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bepo
Nuovo Arrivato
Città: novara
30 Messaggi |
Inserito il - 14 aprile 2008 : 19:09:02
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ciao annamaria! uso il ficol hystopaque e penso che vada bene anche il tuo.. (non l'ho mai sentito penso che siano solo due ditte diverse che lo producono)generalmente faccio il ficoll su buffy coat che sono molto concentrate e diluisco successivamnete 1:4 in PBS1x. uso 20 ml di ficoll su cui stratifico il sangue sino a rrivare a un volume di 50 ml. cfg poi 20 minuti a 1800 rpm senza freno. recupero tutto l'anello di linfociti e "lavo" i linfociti con PBS1x cfg a 1300 giri per 10 min.(con freno); elimino surnatante e lavo con PBS1x 1%FBS (siero) cfg 1300 rpm per 5 minuti, elimino il surnatante e poi risospendo nel terreno di coltura di interesse. riguardo all'anello di linfociti...faccio si immunoflorescenza ma al citofluorimetro..non ho mai provato su vetrino e non vorrei dirti cose sbagliate!!! spero di esserti stato utile.  |
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annamaria_mi
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: milano
18 Messaggi |
Inserito il - 14 aprile 2008 : 21:13:31
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grazie mille, utilissimo..che tu sappia se faccio una centrifugata senza usare il ficoll..con il solo sangue..riesco a separare i globuli rossi?? il mio ficoll è in polvere..non ho capito se è lui che diluisci 1:4 in PBS1x??(scusa ma è la prima volta che lavoro con il sangue ).grazie mille davvero |
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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 14 aprile 2008 : 22:41:40
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Cara Annamaria..ti dico come faccio io..che con il sangue ci lavoro da una vita!
Il Ficoll (io l'ho sempre visto già liquido..denso..ma liquido!) ti permette di separare bianchi..rossi e plasma/siero..Io lavoro in falcon da 15 mL con un rapporto tra ficoll e sangue che deve essere spostato sempre a favore del ficoll (es: 7 mL di ficoll+6mL di sangue..questo è molto importante). Devi stare attenta a stratificare il sangue sul ficoll in maniera delicata..se sei troppo violenta rischi di rompere il polimero (te ne accorgi..il sangue va giù tutto di un botto). Solitamente dopo aver versato le prime gocce si può procedere con maggiore velocità! Man mano che stratifichi il sangue vedrai i primi globuli rossi scendere verso il fondo della falcon, in quanto sono gli elementi più "pesanti" e quindi vanno giù prima..ad ogni modo è una cosa normale..quindi procedi alla centrifugata: 3000 rpm per 15 minuti..meglio se togli il freno alla centrifuga..! Dopo i 15 minuti avrai che i rossi sono sul fondo..e se li devi usare x qualkosa devi lavarli almeno 3 volte con soluzione fisiologica..centrifugando ogni volta a 4000 rpm x 10 minuti; nella parte superiore della falcon c'è il plasma ed al centro ci sono i bianchi che vanno a formare un anello che puoi tranquillamente aspirarti con una pasteur di vetro..! Fai attenzione a non portarti dietro troppo ficoll o plasma..ad ogni modo una volta che li hai separati, i bianki vanno lavati con PBS 1X..facendo 2 centrifugate di 10 minuti a 3000 rpm..dopodikè possono essere usati x tutta una serie di cose. Non so dirti nulla riguardo l'utilizzo per l'immunofluorescenza ma se devi fare il WB puoi lisarli come qualsiasi pellet cellulare..magari usando il RIPA Buffer..o anke qualkosa di meno aggressivo...dipende da come fate nel tuo lab.
Spero di esserti stata utile.
Buon lavoro. |
Farah |
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annamaria_mi
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: milano
18 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2008 : 12:40:53
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il ficoll histopaque che usate tutti è quello della sigma a densità 1077(codice 10771)??..non vorrei prenderne uno sbagliato..
grazie davvero..se avrò bisogno di altro, tenetevi pronti |
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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2008 : 20:51:33
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| Io uso quello Amersham Pharmacia... |
Farah |
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annamaria_mi
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: milano
18 Messaggi |
Inserito il - 23 aprile 2008 : 11:12:06
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| posso chiedervi un altra cosa visto che lavorate con il sangue.. per caso avete mai fatto immunofluorescenza sulle cellule del sangue?il protocollo che utilizzate è sempre lo stesso? procedete con i diversi passaggi su vetrino o in sospensione? grazie mille |
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western blot su sangue
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