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valentina72
Nuovo Arrivato

23 Messaggi

Inserito il - 31 gennaio 2006 : 22:25:19

conoscete un kit per estrarre proteine da tessuti in paraffina o comunque da tessuti?
grazie...

Vale

Tat
Nuovo Arrivato

Citt�: Milano

33 Messaggi

Inserito il - 31 gennaio 2006 : 22:27:09

NO mi dispiace non conosco nessun kit...hai provato a vedere sul sito www.protocol-online.org ?

Prova e in bocca al lupo

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2006 : 00:15:22

Con il Trizol della Sigma mi sembra si possano anche estrarre le proteine oltre a DNA e RNA.

Se vuoi posso anche dirti come estrarre le proteine senza kit, e' molto semplice.

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valentina72
Nuovo Arrivato

23 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2006 : 14:38:38

Citazione:
Messaggio inserito da chick80

Con il Trizol della Sigma mi sembra si possano anche estrarre le proteine oltre a DNA e RNA.

Se vuoi posso anche dirti come estrarre le proteine senza kit, e' molto semplice.

Saresti molto gentile....
Non ho mai "maneggiato" tessuti e tantomeno in paraffina quindi non ho idea di che quantit� possa servire. Io vorrei poi fare dei Western....

Vale

ros
Nuovo Arrivato

Prov.: Bologna

1 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2006 : 19:53:07

ciao...
io conosco l'OMNIzol perchè ci estraggo RNA sia dalle cellule che dai tessuti (però i miei non sono in paraffina) ma è possibile estrarre anche DNA e proteine. Ti segnalo il sito della ditta sperando che possa esserti d'aiuto

www.euroclone.net

data
Nuovo Arrivato

Prov.: Torino
Citt�: Torino

89 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2006 : 20:11:59

Se esiste un kit per estrarre proteine sensatamente da tessuti inclusi in paraffina ne sarei molto felice (ai topastri attualmente estirpo prima un qualsiasi tessuto della panza che proliferi prima di perfonderli...).

http://www.medito.eu.org/vodka/odierno

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2006 : 21:30:48

Una curiosita' data... senza andare in particolari troppo scabrosi... riesci a perfondere i topi anche se prima gli togli pezzi qua e la? Non viene un pasticcio?

=====

Per valentina:

ti dico quello che facevo io per fare western da tessuti (pero non erano in paraffina, ma fresh frozen, quindi magari c'e' qualche step in piu da fare)

Allora, lavorando sempre in ghiaccio:

- mettere il tessuto in una eppendorf (o cmq in una provetta abbastanza grande da contenerlo), aggiungere cocktail di inibitori proteasi/fosfatasi (vedi sotto) + agente di lisi e omogenare con il sonicatore (io facevo 3 passaggi da 10" a potenza media). Io per un ipotalamo di ratto mettevo 500 ul di cocktail di lisi, ovviamente poi aggiusti un po' il volume a seconda della quantita' di tessuto.

- lasciare 15' in ghiaccio

- centrifugare 15' 12000 rpm a 4 gradi

- trasferire il surnatante contenente le proteine in un altra provetta (tenere il pellet, non si sa mai... puoi riestrarre da li' in caso qualcosa vada storto)

- dosare le proteine con il metodo che piu ti piace (Bradford e' il migliore)

====

Cocktail di inibitori: lo puoi comprare gia' pronto o farlo tu come segue

Per 1 ml :

2 ul di EDTA 500 mM
10 ul PMSF hydrocloride 50 mM
10 ul Leupeptina 1ug/ml
5 ul Pepstatina A 2ug/ml
2 ul Aprotinina 1ug/ml
2 ul Antipaina 1ug/ml
1 ul Benzamidina 1mg/ml
2 ul Chimostatina 1 mg/ml
5 ul Na Vanadato 200 mM
5 ul NaF 200 mM

Portare a volume con PBS senza Ca++ e Mg++ (in alternativa TBS)

L'agente di lisi e' NP-40 (Igepal) all'1%

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data
Nuovo Arrivato

Prov.: Torino
Citt�: Torino

89 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2006 : 21:41:19

Viene un pasticcio cmq visto che sono alle prime armi :) Cmq in realt� prendere la milza prima di aprire il torace � fattibile. Altro non ho provato (che il fegato mi serve l� per vederlo cambiar colore...).

http://www.medito.eu.org/vodka/odierno

valentina72
Nuovo Arrivato

23 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2006 : 23:17:32

Citazione:
Messaggio inserito da chick80

............Cocktail di inibitori: lo puoi comprare gia' pronto o farlo tu come segue

Per 1 ml :

2 ul di EDTA 500 mM
10 ul PMSF hydrocloride 50 mM
10 ul Leupeptina 1ug/ml
5 ul Pepstatina A 2ug/ml
2 ul Aprotinina 1ug/ml
2 ul Antipaina 1ug/ml
1 ul Benzamidina 1mg/ml
2 ul Chimostatina 1 mg/ml
5 ul Na Vanadato 200 mM
5 ul NaF 200 mM

Portare a volume con PBS senza Ca++ e Mg++ (in alternativa TBS)

L'agente di lisi e' NP-40 (Igepal) all'1%

A parte che sei bravissimo.....
Per Cocktail di inibitori non � che mi dici anche da chi comprarlo?....

Vale

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2006 : 23:37:14

Non l'ho mai comprato, ma questo della Sigma sembra simile a quello che ti ho scritto sopra:

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/SIGMA/P8340

Leggo che non ci sono chelanti, quindi probabilmente dovrai aggiungerci l'EDTA (e il NaF e NaV forse... ma sinceramente non sono sicuro a cosa servano!)

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valentina72
Nuovo Arrivato

23 Messaggi

Inserito il - 02 febbraio 2006 : 11:20:23

chick80 quanto grande sar� un ipotalamo di ratto?

bl�eeee
Io ho biopsie di 0,5 cm max 1 cm.....UMANE

Vale

valentina72
Nuovo Arrivato

23 Messaggi

Inserito il - 02 febbraio 2006 : 11:21:47

chick80 grazie per le info...credo di aver trovato la persona in grado di darmi suggerimenti!

grazie

Vale

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 02 febbraio 2006 : 12:11:06

un ipotalamo di ratto e' piccino... sta nel fondo di una eppendorf da 1.5 ml!

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