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valentina72
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
 Inserito il - 31 gennaio 2006 : 22:25:19
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conoscete un kit per estrarre proteine da tessuti in paraffina o comunque da tessuti?
grazie...
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Vale |
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Tat
Nuovo Arrivato
Città: Milano
33 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2006 : 22:27:09
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NO mi dispiace non conosco nessun kit...hai provato a vedere sul sito www.protocol-online.org ?
 Prova e in bocca al lupo |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2006 : 00:15:22
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Con il Trizol della Sigma mi sembra si possano anche estrarre le proteine oltre a DNA e RNA.
Se vuoi posso anche dirti come estrarre le proteine senza kit, e' molto semplice. |
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valentina72
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2006 : 14:38:38
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Con il Trizol della Sigma mi sembra si possano anche estrarre le proteine oltre a DNA e RNA.
Se vuoi posso anche dirti come estrarre le proteine senza kit, e' molto semplice.
Saresti molto gentile....
Non ho mai "maneggiato" tessuti e tantomeno in paraffina quindi non ho idea di che quantità possa servire. Io vorrei poi fare dei Western.... |
Vale |
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ros
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
1 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2006 : 19:53:07
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ciao...
io conosco l'OMNIzol perchè ci estraggo RNA sia dalle cellule che dai tessuti (però i miei non sono in paraffina) ma è possibile estrarre anche DNA e proteine. Ti segnalo il sito della ditta sperando che possa esserti d'aiuto 
www.euroclone.net |
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data
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
89 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2006 : 20:11:59
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| Se esiste un kit per estrarre proteine sensatamente da tessuti inclusi in paraffina ne sarei molto felice (ai topastri attualmente estirpo prima un qualsiasi tessuto della panza che proliferi prima di perfonderli...). |
http://www.medito.eu.org/vodka/odierno |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2006 : 21:30:48
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Una curiosita' data... senza andare in particolari troppo scabrosi... riesci a perfondere i topi anche se prima gli togli pezzi qua e la? Non viene un pasticcio?
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Per valentina:
ti dico quello che facevo io per fare western da tessuti (pero non erano in paraffina, ma fresh frozen, quindi magari c'e' qualche step in piu da fare)
Allora, lavorando sempre in ghiaccio:
- mettere il tessuto in una eppendorf (o cmq in una provetta abbastanza grande da contenerlo), aggiungere cocktail di inibitori proteasi/fosfatasi (vedi sotto) + agente di lisi e omogenare con il sonicatore (io facevo 3 passaggi da 10" a potenza media). Io per un ipotalamo di ratto mettevo 500 ul di cocktail di lisi, ovviamente poi aggiusti un po' il volume a seconda della quantita' di tessuto.
- lasciare 15' in ghiaccio
- centrifugare 15' 12000 rpm a 4 gradi
- trasferire il surnatante contenente le proteine in un altra provetta (tenere il pellet, non si sa mai... puoi riestrarre da li' in caso qualcosa vada storto)
- dosare le proteine con il metodo che piu ti piace (Bradford e' il migliore)
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Cocktail di inibitori: lo puoi comprare gia' pronto o farlo tu come segue
Per 1 ml :
2 ul di EDTA 500 mM
10 ul PMSF hydrocloride 50 mM
10 ul Leupeptina 1ug/ml
5 ul Pepstatina A 2ug/ml
2 ul Aprotinina 1ug/ml
2 ul Antipaina 1ug/ml
1 ul Benzamidina 1mg/ml
2 ul Chimostatina 1 mg/ml
5 ul Na Vanadato 200 mM
5 ul NaF 200 mM
Portare a volume con PBS senza Ca++ e Mg++ (in alternativa TBS)
L'agente di lisi e' NP-40 (Igepal) all'1%
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data
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
89 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2006 : 21:41:19
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| Viene un pasticcio cmq visto che sono alle prime armi :) Cmq in realtà prendere la milza prima di aprire il torace è fattibile. Altro non ho provato (che il fegato mi serve lì per vederlo cambiar colore...). |
http://www.medito.eu.org/vodka/odierno |
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valentina72
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2006 : 23:17:32
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
............Cocktail di inibitori: lo puoi comprare gia' pronto o farlo tu come segue
Per 1 ml :
2 ul di EDTA 500 mM
10 ul PMSF hydrocloride 50 mM
10 ul Leupeptina 1ug/ml
5 ul Pepstatina A 2ug/ml
2 ul Aprotinina 1ug/ml
2 ul Antipaina 1ug/ml
1 ul Benzamidina 1mg/ml
2 ul Chimostatina 1 mg/ml
5 ul Na Vanadato 200 mM
5 ul NaF 200 mM
Portare a volume con PBS senza Ca++ e Mg++ (in alternativa TBS)
L'agente di lisi e' NP-40 (Igepal) all'1%
A parte che sei bravissimo.....
Per Cocktail di inibitori non è che mi dici anche da chi comprarlo?....
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Vale |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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valentina72
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
Inserito il - 02 febbraio 2006 : 11:20:23
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chick80 quanto grande sarà un ipotalamo di ratto? blèeeee
Io ho biopsie di 0,5 cm max 1 cm.....UMANE |
Vale |
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valentina72
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
Inserito il - 02 febbraio 2006 : 11:21:47
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chick80 grazie per le info...credo di aver trovato la persona in grado di darmi suggerimenti! grazie |
Vale |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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