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crischi
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 08 luglio 2008 : 17:26:27
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Ciao a tutti mi chiamo cristina,
ho un problema e non riesco a risolverlo.....non riesco a fare un clonaggio...l'unico risultato che ho sono dei plasmidi non plasmidi resistenti alla kanamicina ......nelle piastre si presentano colonie molto piccole, dallo screening ovviamente non si capisce niente.....non sono ricchiusi .....crescono in terreno con kana ma sul gel d'agarosio non c'è nessuna banda...
cosa puo? essere?
una contaminazione? di che?
aiutatemi
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lunissima
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
6 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2008 : 20:10:45
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Potrebbe essere che hai(ad esempio nelle pipette) un plasmide contaminanteche che porta anch'esso la resistenza alla kanamicina! Così i batteri sono resistenti e crescono su terreno selettivo ma analizzi le colonie per restrizione o per PCR non viene fuori nessuna banda!!!
Alternativamente se queste colonie negative sono molto più piccole del normale potrebbe essere che si è rovinato l'antibiotico ma questo lo vedi bene da quello che cresce sulla piastra di controllo in cui piastri i batteri non trsformati! |
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Clivi
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
 Inserito il - 08 luglio 2008 : 20:35:36
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Ciao...io purtroppo non posso esserti utile ma avrei bisogno di capire un problema inerente...
qual'è la differenza tra selezione positiva e negativa in lievito...mi aiutate a capirla?
Se per esempio ho il gene URA3, il cui inibitore è il FOA, cosa avrò nei ceppi URA3+? e nei ceppi URA3-? perchè i ceppi URA3- sono resistenti al FOA?
Un grazie in anticipo! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2008 : 22:54:50
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Citazione:
Messaggio inserito da Clivi
Ciao...io purtroppo non posso esserti utile ma avrei bisogno di capire un problema inerente...
qual'è la differenza tra selezione positiva e negativa in lievito...mi aiutate a capirla?
Se per esempio ho il gene URA3, il cui inibitore è il FOA, cosa avrò nei ceppi URA3+? e nei ceppi URA3-? perchè i ceppi URA3- sono resistenti al FOA?
Un grazie in anticipo!
Beh non mi sembra sia inerente  , forse era meglio aprire una discussione a parte...
Comunque:
Il gene URA3 codifica per la orotidina-5’-fosfato decarbossilasi che è un enzima importante per la via biosintetica dell’Uracile.
Ceppi URA3- saranno incapaci di sintetizzare uracile e quindi non possono crescere su terreno privo di uracile (o uridina) --> selezione positiva
Ma la orotidina-5’-fosfato decarbossilasi converte anche il 5-FOA (acido 5-fluoroorotico) in 5-fluorouracile che è un composto tossico per le cellule (è un analogo della pirimidina).
Se ceppi URA3+ vengono fatti crescere su terreno contenente 5-FOA non saranno in grado di sopravvivere --> selezione negativa
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2008 : 23:03:01
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Citazione:
Messaggio inserito da crischi
Ciao a tutti mi chiamo cristina,
ho un problema e non riesco a risolverlo.....non riesco a fare un clonaggio...l'unico risultato che ho sono dei plasmidi non plasmidi resistenti alla kanamicina ......nelle piastre si presentano colonie molto piccole, dallo screening ovviamente non si capisce niente.....non sono ricchiusi .....crescono in terreno con kana ma sul gel d'agarosio non c'è nessuna banda...
cosa puo? essere?
una contaminazione? di che?
aiutatemi
Ciao Cristina, innanzitutto benvenuta sul forum! 
Per quanto riguarda la tua domanda, non ho capito bene le questione.
Cosa sarebbero i plasmidi non plasmidi? Cosa vorrebbe dire che non sono richiusi? Che analisi hai fatto? PCR, restrizione?
Per il resto potrebbe essere come ha detto lunissima.
Hai già lavorato con altri plasmidi che dessero resistenza alla kanamicina? Hai utilizzato le stesse pipette? |
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pistilin
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
9 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2008 : 23:10:39
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ciao,
prima di tutto controlla dalla mappa di restrizione del vettore in cui cloni ke sia effettivamente resistente alla Kana...e solo x quello...
poi controlla la bontà del tuo antibiotico...magari è scaduto..
oppure può essere ke la ligasi nn ha funzionato(o per l' enzima o per il buffer) e nn hai inserito nessun farmmento....
io ho avuto il tuo stesso problema con il mio clonaggio e alla fine ho scoperto ke il plesmide nn era realmete resistente alla Kana....sono impazzita x due mesi
e per risolvere feci tutte queste prove...
spero esserti stata utile
ciao |
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Clivi
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2008 : 23:16:08
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Grazie GFPina...hai ragione...mi sono accorta troppo tardi che non era lo stesso argomento! 
Ad ogni modo ora mi è chiara la differenza! Grazie per la risposta!  |
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crischi
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 09 luglio 2008 : 10:06:07
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Messaggio inserito da lunissima
Potrebbe essere che hai(ad esempio nelle pipette) un plasmide contaminanteche che porta anch'esso la resistenza alla kanamicina! Così i batteri sono resistenti e crescono su terreno selettivo ma analizzi le colonie per restrizione o per PCR non viene fuori nessuna banda!!!
Alternativamente se queste colonie negative sono molto più piccole del normale potrebbe essere che si è rovinato l'antibiotico ma questo lo vedi bene da quello che cresce sulla piastra di controllo in cui piastri i batteri non trsformati!
le analisi che ho fatto sono per PCR...ho usato degli oligo esterni che mi hanno fatto capire che non è un richiuso...invece gli oligo interni mi hanno fatto capire che non c'è l'inserto...dalla PCR non viene fuori nessuna banda.
per quanto riguarda l'antibiotico non credo sia scaduto anche perchè viene usato anche dai miei colleghi che non hanno problemi...e poi mi succede anche con un altro vettore che ha la resistenza alla tetraciclina |
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crischi
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 09 luglio 2008 : 10:25:09
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Ciao Cristina, innanzitutto benvenuta sul forum!
Per quanto riguarda la tua domanda, non ho capito bene le questione.
Cosa sarebbero i plasmidi non plasmidi? Cosa vorrebbe dire che non sono richiusi? Che analisi hai fatto? PCR, restrizione?
Per il resto potrebbe essere come ha detto lunissima.
Hai già lavorato con altri plasmidi che dessero resistenza alla kanamicina? Hai utilizzato le stesse pipette?
[/quote]
grazie
io gli definisco plasmidi non plasmidi......per non chiamarli mostri.....perchè se metto queste colonie che, crescono in terreno con kana, in coltura e poi estraggo il dna plasmidico, dal gel non si vede nessuna banda.
quello che uso è un vettore che normalmente viene usato nel nostro laboratorio e che non ci dà tutti questi proplemi....è anche vero che ogni tanto, a turno, abbiamo questi problemi......ho cambiato tutti i buffer e le ligasi...l'unica cosa che mi resta da fare e pulire tutto nuovamente e cercare di sterilizzare le mie pipette!!!!!
speriamo bene
grazie |
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plasmidi non plasmidi resistenti alla kanamicina
Didattica
