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Frin74
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
 Inserito il - 04 settembre 2008 : 02:10:29
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salve a tutti sono Francesca...ho bisogno di un consiglio...e cioè sono alle prese per la prima volta con la tecnica dell'immunofluorescenza sulla linea cellulare HEK 293. Il mio esperimento consiste nell'irradiare le cellule con UV e poi sottoporle ad immunofluorescenza ma come ben sapranno coloro che lavorano con queste cellule, si staccano con una grandissima facilità…ho provato anche a seminale su gelatina al 5% ma nulla da fare…perché dopo due lavaggi con PBS e UV le cellule si staccano quasi tutte…come devo fare??
grazie
Frin
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2008 : 10:40:51
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io ho lo stesso problema con le HeLa mitotiche, nel senso che le cellule aderiscono bene alla coverslip ma quando sono mitotiche si staccano facilmente e purtroppo a me servono solo quelle mitotiche!!!
comunque nel mio lab facciamo così:innanzitutto il coating lo facciamo con fibronectina, poi, per i lavaggi, aspira sempre molto lentamente e quando metti a incubare, rovescia il vetrino su una goccia di Ab messa su parafilm, quando poi devi staccare il vetrino evita di prenderlo direttamente dal parafilm (si crea un effetto ventosa), ma con un puntale metti 200 um di PBS tra vetrino e parafilm, così il vetrino si solleva e puoi prenderlo con le pinze facendolo scivolare lungo la goccina. è più facile farlo che dirlo.
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Frin74
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2008 : 18:38:54
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grazie per le risposte....comunque il mio problema è a monte e cioè le cellule si staccano quando faccio i lavaggi con PBS prima dell'irradiazione con UV e in ogni caso aspiro manualmente usando sempre la micro pipetta in modo tale da regolare la forza...accidenti non le sopporto proprio  ...comunque posso provare con fibronectina e seguire anche l'altro consiglio
Thanks
Frin |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2008 : 19:28:57
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Citazione:
ma con un puntale metti 200 um di PBS tra vetrino e parafilm, così il vetrino si solleva e puoi prenderlo con le pinze facendolo scivolare lungo la goccina. è più facile farlo che dirlo.
Aaaargh, ma come fai a non impazzire?? Io già divento nervosissimo normalmente
quando devo acchiappare vetrini con la pinzetta, ma figuriamoci così!!  |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2008 : 19:33:55
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Frin74, ti faccio una domanda scontata per cui odiami pure se la consideri
stupida ma .... stai spipettando CONTRO la parete tenendo INCLINATA la piastra di coltura, vero???
In genere si fanno così i lavaggi con le HEK, e in teoria così non
dovrebbero staccarsi per niente (almeno quelle sane, visto che tratti con UV).
Inoltre se lavori con vetrini in multiwell ti viene incontro il
fatto che il vetrino non occupa tutta la superficie ma solo la
zona centrale del pozzetto, per cui inclinando la multiwell è fatta. |
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Frin74
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2008 : 23:20:32
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| mio caro Dyonisos...si ti sto odiando...ovviamente tengo inclinata la piastra e faccio tutto con estrema delicatezza e quando metto il PBS lo aggiungo sempre lateralemte facendolo scivolare lungo la parete...e poi uso le multiwell da 24 per cui ho spazio tra il vetrino e la parete...anyway grazie per i consigli, in queste situazioni accetto tutto anche quello più banale che può sempre sfuggire! ho una buona esperienza in lab ma haimè le 293 come dici te mi fanno innervosire alquanto, mentre mi diverto e mi rilasso quando devo prendere i vetrini con la pinzetta..mi chiedo ma te quando fai questo passaggio ovviamente lasci PBS nel pozzetto vero? non lo fai a secco?...ora non mi odiare te!!!! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 05 settembre 2008 : 01:32:31
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Cos'è una domanda trabocchetto? in risposta alle mie?
Ovviamente no! a secco il vetrino si appiccica e tirarlo su è da disperarsi
Comunque se le HEK si staccano perfino così (con la delicatezza
che dici di usare) forse son proprio stecchite! Troppi UV?
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Frin74
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 05 settembre 2008 : 01:57:15
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| ma ho provato a fare il saggio BrdU....altro problema...le HEK tarttate stanno meglio di quelle non trattate cioè incorporano tranquillamente BrdU il che vuol dire che vanno tranquille per la loro strada a sintetizzare DNa e a dividersi....mannaggia...son disperata anche perchè per due volte l'esperimento è venuto questa volta no!! |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 05 settembre 2008 : 09:50:23
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Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
Citazione:
ma con un puntale metti 200 um di PBS tra vetrino e parafilm, così il vetrino si solleva e puoi prenderlo con le pinze facendolo scivolare lungo la goccina. è più facile farlo che dirlo.
Aaaargh, ma come fai a non impazzire?? Io già divento nervosissimo normalmente
quando devo acchiappare vetrini con la pinzetta, ma figuriamoci così!!
no anzi, mi trovo meglio perchè il vetrino galleggia sulla goccia di PBS e prenderlo è molto più semplice e poi si riduce il rischio di spaccarlo! provare per credere  |
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giosorre
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8 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2008 : 17:15:37
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| devi semplicemente comprare la POLILISINA e trattare i vetrini con questa soluzione prima di seminare le cellule. vedrai che non si staccano!!! |
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elly_
Utente Junior
400 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2008 : 22:49:44
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Citazione:
Messaggio inserito da giosorre
devi semplicemente comprare la POLILISINA e trattare i vetrini con questa soluzione prima di seminare le cellule. vedrai che non si staccano!!!
confermo la poly-D-lys va da dio!! |
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Frin74
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 10 settembre 2008 : 02:39:08
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mi pare di aver capito che il trattamento di vetrini con polilisina e' semplice e cioe' applico una goccia di polilisina sul vetrino, lascio per 30 minuti e poi lavo con acqua lascio asciugare ( credo a temperatura ambiente e poiche' non so se usta polilisina sia sterile, lascero' asciugare sotto gli UV ...pero' non so per quanto!!!)e poi posso seminare le HEK293....giusto?
se avete suggerimenti per il protocollo fatemi sapere..thanks
Frin |
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giosorre
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 10 settembre 2008 : 11:51:00
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| la poli è sterile, diluiscila 1:10 in una soluzione salina e mettine 1ml per pozzetto(vetrino). Dopo mezz'ora aspira, fai un paio di lavaggi in salina e poi semina le cellule. |
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