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CRISTIAN
Nuovo Arrivato
92 Messaggi |
 Inserito il - 12 settembre 2008 : 11:16:33
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Ciao a tutti!
Dovrei clonare due geni in un unico vettore per produrre due proteine ricombinanti fuse assieme in E coli, qualcuno ha qualche consiglio di quale vettore usare o con quale sistema?
Ho sentito l'invitrogen che propone il Gateway ma mi sembra un pò costoso..anche perchè devo solamente clonarlo in un vettore di espressione procariotico.
Qualcuno ha qualche consiglio o qualche alternativa?
Di un gene ho già la sequenza di cDNA, l'altro gene è la mu chain delle IgM human, però ho difficoltà a trovare l'mRNA, qualcuno ha a disposizione o conosce la sequenza di µ chain human mRNA?
Grazie infinite
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 12 settembre 2008 : 11:24:42
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Io ho trovato molto comodo il sistema pET
per clonare in cellule BL21 di E. Coli. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato
92 Messaggi |
Inserito il - 12 settembre 2008 : 11:31:09
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Certo, anch'io ho usato il sistema pET, ma ti permette di clonare due geni unendoli mediante un tag?
come posso fare? |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 12 settembre 2008 : 11:46:22
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Forse potresti fondere i due ampliconi in vitro, usando un linker.
Tipo: disegni due primers in parte complementari al linker e in parte
complementari alle due estremità e li usi per creare un amplicone unico.
So che questo metodo si usa con i SCFV (single-chain fragment variable)
per farci phage display e penso non sia dissimile da quello che vuoi ottenere,
visto che se ho capito bene stai clonando catene anticorpali.
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato
92 Messaggi |
Inserito il - 12 settembre 2008 : 11:50:36
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un gene è la catena u chain delle IgM (a proposito qualcuno riesce a trovare l'mRNA??), l'altro gene è semplicemente una citochina.
Io preferivo "fondere" i due geni direttamente nel vettore, qualche alternativa al gateway? si possono fondere direttamente nel pET?
Grazie |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 12 settembre 2008 : 15:34:34
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| io farei un doppio clonaggio, se non ho capito male vuou clonare e far esprimere la u chain come proteina di fusione; in tal caso clonerei prima la citochina priva del codone di stop e nel primer reverse con cui amplifichi la citochina al 5' ci metti due siti di restrizione (diversi da quelli del polylinker naturalmente) per clonarci in seguito la u chain. in questo modo si perde tempo ma hai una buona percentuale di successo |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Ancora clonaggio
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