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Discussione |
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biotecman
Nuovo Arrivato
40 Messaggi |
 Inserito il - 14 giugno 2008 : 14:02:29
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ragazzi potete togliermi un dubbio: nell'immunoblotting gli anticorpi primari utilizzati riconoscono epitopi lineari o conformazionali? Ho trovato scritto su alcuni appunti della prof. che vengono riconosciuti epitopi lineari (mentre si usa l'elisa per epitopi conformazionali), ma nel corso del trasferimento l'SDS non dovrebbe essere allontanato permettendo alle proteine di ritornare in conformazione nativa?
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gianpierolandolfi
Nuovo Arrivato
84 Messaggi |
Inserito il - 14 giugno 2008 : 14:44:18
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Durante la fase di blotting si usa il tampone di trasferimento che contiene tris, glicina e metanolo. Niente SDS.
L'SDS si usa solo durante SDS-PAGE appunto in modo da separare le proteine in base al loro peso molecolare.
Non mi sono mai posto la domanda se dopo che fossero corse e durante il blotting potessero rifoldare...Onestamente non so come sia possibile che duante il trasferimento le proteine si possano rifoldare.
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 14 giugno 2008 : 15:05:53
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| nel transfer che usiamo noi c'è anche l'SDS.. |
Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
errore di stampa... |
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gianpierolandolfi
Nuovo Arrivato
84 Messaggi |
Inserito il - 14 giugno 2008 : 15:23:58
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interessante, nyo84 non lo sapevo.
Quindi secondo l'esperienza del tuo laboratorio sarebbe possbile che durante il blotting le proteine si rinaturino e quindi ci aggiungete l'SDS per sicurezza? |
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biotecman
Nuovo Arrivato
40 Messaggi |
Inserito il - 14 giugno 2008 : 15:28:52
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| io ho trovato scritto in particolare con sull'abbas, un libro di immunologia, che durante il trasferimento l'sds viene allontanato e quindi le proteine si rinaturano e proprio per questo possono essere riconosciute dagli anticorpi... |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 14 giugno 2008 : 16:10:28
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| come nyo84, anche nel transfer buffer che uso io c'è l'SDS. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 14 giugno 2008 : 16:16:51
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tecnicamente non so quanto possano rifoldare..anche perchè cmq devono poi fissarsi alla membrana di nitrocellulosa e presumo lo facciano con i gruppi amminici ad es delle lisine...quindi magari un refolding potrebbe diminuire i siti liberi per legare la membrana e questo potrebbe portare a perdita di prot...gli anticorpi non so quanto abbiano bisogno della proteina in struttura nativa per riconoscerla..perchè alcuni riconoscono solo piccoli tratti che magari in struttura nativa sono nascosti o non accessibili..
se devo essere sincero non mi ero mai posto il quesito.. |
Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
errore di stampa... |
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Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2008 : 13:53:26
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io ho sempre saputo che riconoscevano epitopi lineari e se l'anticorpo non riconosceva un epitopo lineare bensì conformazionale era necessario fare un'elettroforesi in condizioni native. Inoltre talvolta gli epitopi riconosciuti possono essere di pochi aa e che quindi possono essere riconosciuti sia in condizioni native che in condizioni denaturate.
ciao |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2008 : 18:17:32
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La vedo un po' difficile la "rinaturazione spontanea" delle proteine sulla membrana, dopo essere state denaturate e magari anche ridotte... in vivo per un corretto folding delle proteine c'è bisogno delle "chaperonine"!!! Sulla membrana perchè si dovrebbero "rifoldare" così?
(alcune potrebbero anche rifoldarsi, ma certamente non tutte!)
L'SDS non è necessario per il blot, ma viene spesso utilizzato comunque a volte (come nel mio caso) solo per questioni di comodità: si utilizza lo stesso buffer dell'elettroforesi con l'aggiunta di metanolo.
In alcuni casi non è consigliato utilizzarlo, ad es. perchè può dare problemi con alcuni sistemi di rivelazione (ad es. Odyssey (Licor)).
In genere per avere proteine in conformazione nativa si fa una Native-PAGE al posto dell'SDS-PAGE.
Ad es. nel Far-Western (che simpatici quelli che si inventano i nomi delle tecniche!  ) in cui si va a vedere l'interazione proteina:proteina e quindi si utilizza al posto dell'anticorpo una proteina che dovrebbe interagire con la prima è infatti consigliato fare una Native-PAGE.
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biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
Prov.: Rm
Città: Roma
69 Messaggi |
Inserito il - 21 giugno 2008 : 00:10:41
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| Beh nel mio lab (ma credo nella maggior parte) prima di caricare le proteine in SDS-PAGE le facciamo bollire per 5 minuti e non so quanto possa essere possibile, successivamente, un refolding delle proteine pur non essendoci l'SDS nel tampone di trasferimento(in quello che usiamo noi c'è. Magari mi sbaglierò ma è cmq una considerazione personale. |
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biolala
Nuovo Arrivato
Prov.: Pisa
Città: Pisa
16 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2008 : 10:43:39
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HELP ME PLEASEEEEEE!!!
Ciao a tutti...ho seri problemi con un Western Blot (entro fine mese dovrei ottenere qualcosa...AIUTATEMI!!!).
Prima di eseguire il mio WB ho fatto un dot blot per mettere appunto alcune cose: blockin solution e concentrazioni Ab: il dot blot mi viene perfetto!!!
Riporto tutto nel WB, quindi in più al dot blot, faccio la corsa elettroforetica e il trasferimento in membrana PVDF...fin qui tutto bene poichè il Ponceau me ne dà la conferma!!!
Al momento dello sviluppo ottengo SEMPRE lastre nere anche cambiamdo i tempi di esposizione della lastra (lastra che taglio al buio completo per non far prendere luce!).
Qualcuno mi sa dare qualche consiglio???
Grazie mille in anticipo |
biolala |
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gianpierolandolfi
Nuovo Arrivato
84 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2008 : 15:13:53
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Se le lastre sono nere potrebbe essere che precedentemente siano state esposte alla luce.
Prova a prendere l'ultima lastra...partendo dal coperchio, la zona meno esposta.
In base alla mia esperienza nono trovo alla spiegazione. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2008 : 15:43:36
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Che tempi di esposizione usi?
Rifai le soluzioni di sviluppo e poi sviluppa direttamente una lastra senza metterla a contatto con la membrana, in modo da vedere se è un problema delle lastre. |
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biolala
Nuovo Arrivato
Prov.: Pisa
Città: Pisa
16 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2008 : 16:45:01
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| sono partita da 10 minuti, poi 5 e poi 3...risultato sempre uguale!!! |
biolala |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2008 : 20:32:38
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Beh, conta che io per alcune proteine facevo esposizioni di 3-4 secondi, quindi magari è un semplice problema di sovraesposizione.
Fai quella prova con la lastra non esposta e poi facci sapere!
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
Inserito il - 21 novembre 2008 : 08:52:38
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Ma buio comlpeto nel senso che non vedi nulla neanche tu??? Se fosse così ti consiglio davvero caldamente una luce rossa, almeno così capisci quando bloccare l'esposizione ad occhio. Basta usare una torcia qualunque e appiccicarci sopra una serie di strati di plastica trasparente rossa (quelli che si usavano una volta alle elementari per ricoprire i quaderni) fino a rendere la luce molto flebile.
E' semplicissima da fare e ti risolve la vita. |
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biolala
Nuovo Arrivato
Prov.: Pisa
Città: Pisa
16 Messaggi |
Inserito il - 21 novembre 2008 : 14:20:51
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| No no..la luce rossa c'è in camera oscura altrimenti come fò... |
biolala |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 21 novembre 2008 : 14:37:30
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Citazione:
[i]
Non mi sono mai posto la domanda se dopo che fossero corse e durante il blotting potessero rifoldare...Onestamente non so come sia possibile che duante il trasferimento le proteine si possano rifoldare.
se sulla membrana ci sono le chaperonine e condizioni ottimali certo che si rifoldano |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 21 novembre 2008 : 19:28:28
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Citazione:
se sulla membrana ci sono le chaperonine e condizioni ottimali certo che si rifoldano
Nel remotissimo caso in cui le chaperonine abbiano lo stesso peso molecolare della tua proteina... |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 08:40:37
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| era una ba ttuta chick |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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immunoblotting
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