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Discussione |
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adaniele
Nuovo Arrivato
Prov.: Pistoia
Città: lamporecchio
11 Messaggi |
 Inserito il - 17 marzo 2008 : 18:57:20
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qualcuno mi puo dire come si determina in quale aliquota del volume di eluizione si trova la massima concentrazione dell'analita da separare?
è possibile che cio' si determini dividendo il volume di eluizione per due.
grazie a coloro che mi sapranno aiutare
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hurricane86
Nuovo Arrivato
50 Messaggi |
Inserito il - 18 marzo 2008 : 16:39:07
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bhe la cosa non è cos' semplice, anche perche nel tuo volume di eluizione ci saranno pure altre proteine che scenderanno dalla colonna cromatografica con tempistiche diverse.
Noi in laboratorio abbiamo collegato la colonna della cromatografia ad uno spettrofotometro ad 280nm per il rilevamento della presenza di proteine, poi il liquido veniva ditribuito da....(non mi ricordo come si chiama, è un coso con le provette numerate messe a spirale, che riporta anche in via grafica i picchi registrati e li associa al numero della provetta)...in volumi di 3ml.
Ovviamente non tutti i picchi sono buoni, se non hai la più pallida idea di dove possa cadere la tua proteina, prelevi dalle provette con un picco di assorbanza un'aliquota e fai un saggio di attività nello spettrofotometro.
Per calolare il volume finale, riunisci il pool di provette contenenti la proteina desiderata
....non sò se ci siano altre metodiche, sarò ben lieta se me ne insegnerete altre |
Think I'll lose my mind if I don't find something to pacify
....muore lentamente chi non esplora cio che non conosce.... |
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hurricane86
Nuovo Arrivato
50 Messaggi |
Inserito il - 18 marzo 2008 : 17:06:20
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spe!!!
mi sono appena ricordata di una formula, ma ti consiglio di ricontrollare:
Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)
dove Ve è il volume di eluizione
Vo lo spazio vuoto/esterno alle "palline" che usi per filtrare
Vt= volume totale
Kav=coefficiente di partizione |
Think I'll lose my mind if I don't find something to pacify
....muore lentamente chi non esplora cio che non conosce.... |
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123Vale
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57 Messaggi |
Inserito il - 18 marzo 2008 : 21:02:44
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Ciao! Allora prima di tutto devi tener conto che la cromatografia d'esculsione ti permette di separare famiglie di proteine all'interno della tua miscela di analiti sconosciuti. questo significa che in ogni tuo picco di eluizione avrai delle proteine che differiscono per poco nel peso molecolare e che verranno escluse o permeate in ugual modo e perciò saranno nello stesso picco; per separare specificatamente una singola proteina dalla miscela di analiti si possono operare altri metodi di separazione.
In questa metodica tu hai una colonna cromatografica che viene caricata di determinato materiale(fase fissa) e in seguito a caratteristiche chimico fisiche di questa si separano le tue proteine all'interno della fase mobile che tu carichi. Ci saranno proteine che una volta caricate usciranno subito, vuol dire che hanno interazione nulla con la fase fissa e vengono dette"escluse". Le proteine che saranno nell'ultimo picco d'eluizione invece saranno quelle maggiormente "permeate" e perciò sono quelle che interagiscono di più con la fase fissa.
Perchè parlo di picchi? Perchè tu carichi la tua miscela di analiti ed esce del volume detto d'eluizione ma tu non sai in quel volume quanto materiale dell'analita è presente. La quantità di materiale che si trova nel volume viene determinata da uno spettrofotometro che misura l'assorbanza del volume.
Ora per conoscere il volume d'eluizione di una proteina questo ti viene dato dalla formula:
Ve= Vo- (1- Kr)
dove:
Ve è il tuo volume d'eluizione
Vo è il volume della colonna cromatografica riempita solo delle particelle della fase fissa
Kr è il coefficente di ripartizione e nelle molecole subito escluse è zero, mentre in quelle maggiormente permeate è uno.
Il conoscere il tuo volume d'eluizione è molto utile perchè se precedentemente hai usato cromatografia d'esclusione con degli standard a correspettivi valori di volume d'eluizione potevi segnarti i pesi molecolari; perciò se ti costruisci una curva di taratura e sull'asse x metti il volume d'eluizione e sull'asse y metti i pesi molecolari degli standard, quando hai il volume d'eluizione della tua proteina( famiglia di proteine) incognita puoi sapere anche il suo peso molecolare.
Quel macchinario che hurricane ti ha descritto che sta sotto la colonna cromatografica e prende sempre lo stesso volume uscente(3 ml) e poi tramite lo spettrofotometro ti dice quando materiale hai in ogni provetta da 3 ml...si chiama collettore di frazioni.
ciao |
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roselady
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: napoli
119 Messaggi |
Inserito il - 09 gennaio 2009 : 18:28:45
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| ragazzi scusatemi se mi intrometto in questa discussione ma sono capitata anke io nello stesso problema..ho kapito un po in piu grazie a voi ma qualkosa nn è ankora kiaro! allora..cromatografia gel filtrazione...4 proteine:emoglobina alfa amilasi rnasi a e blu di bromofenolo...devo calcolare il ve per ognuna..ma come si fa ?ho visto le formule k avete scritto..però mi chiedo:dato che si tratta di 4 proteine...quale valora di k av uso per i due composti intermedi??? e poi ancora...il vo sarebbe il volume della colonna e vi il volume della resina???spero che possiate aiutarmi..grazie mille e scusate per il disturbo.. |
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Discussione |
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cromatografia per esclusione aiuto!!!!
Didattica
