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tkiara
Nuovo Arrivato
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 Inserito il - 01 febbraio 2009 : 10:44:31
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ciao a tutti!Ho un esperimento in cui si vuole vedere se RNF11 interagisce nel pathway di segnalazione di NF-kB.
Quindi, ho delle cellule che vengono trasfettate con: 1)un controllo siRNA scrambled (che non so bene cosa sia),2)un mRNA di RNF11 silenziato tramite knockdown con siRNA,3) RNF11 w.t.
Queste cellule vengono trattate con TNF e i risultati che si osservano sono che in presenza di TNF e RNF11 w.t non c'è tracrizione di NF-KB mentre con RNF11 silenziato c'è un alta trascrizione di NF-KB.
Fin qui ok, ma quello che non capisco è perchè i risultati ottenuti dal controllo siRNA scrambled sono molto simili a quelli con RNF11 silenziato, dato che nel controllo scrambled, RNF11 si dovrebbe esprimere....
Grazie a tutti!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2009 : 11:03:00
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TEORIA: lo scrambled (=mischiato) è un siRNA in cui la sequenza di nucleotidi è mischiata casualmente, quindi non dovrebbe dare alcun effetto. Se hai un effetto dello scrambled:
1) rifai l'esperimento facendo attenzione a tutti i passaggi (magari per sbaglio hai pipettato il siRNA di RNF11 invece dello scrambled)
2) se il risultato viene ancora uguale allora c'è qualche problema nella tua procedura
Ora fammi capire bene, perchè c'è qualcosa che non mi torna nel tuo esperimento... (magari ho solo capito male quello che fai)
Le tue cellule esprimono RNF11? Se sì, perchè transfetti con RNF11 nel gruppo 3? E se no, perchè non trasfetti RNF11 nel gruppo 1?
E cosa trasfetti esattamente nel gruppo 2?
Io prenderei una linea di cellule esprimenti RNF11 (di loro o trasfettate stabilmente) e poi tratterei con TNF in cellule non trattate, in cellule trattate con siRNA scrambled e in cellule trattate con siRNA per RNF11. |
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tkiara
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2009 : 11:15:43
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Allora ti spiego meglio...le cellule che io tratto sono THP1 ed esprimono RNF11 endogeno.Quello che si fa è silenziare RNF11 endogeno (caso 2), sovraesprimere RNF11 trasfettandolo nella cellula(caso 3)e trasfettare siRNA scrambled ,a questo punto non specifico per RNF11,(caso 1).L'induzione di NF-KB che si registra nel caso 2 è di poco più alta rispetto a quella del caso 1, il problema è che questi risultati devono essere giusti per forza dato che l'esperimento è stato pubblicato nell' EMBO JOURNAL!!!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2009 : 11:24:29
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Ok, non avevo capito bene l'esperimento! Non lo discutono nell'articolo?
Se mi dai il titolo provo a leggerlo e poi ti so dire (l'altra opzione ovviamente è chiedere agli autori).
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tkiara
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2009 : 11:28:15
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ok forse ho capito da sola...l'esperimento vuole solo dire che RNF11 endogeno (caso 1)comunque abbassa l'induzione di NF-kb rispetto al caso di totale assenza di RNF11 (caso 2), e il dato che rafforza questa ipotesi è proprio la sovraespressione di RNF11 ectopico che fa ottenere un vero crollo della trascrizione di NF-kb. Secondo te fila come ragionamento?
Già che ci siamo ti posso chiedere anche un altra cosa? |
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tkiara
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2009 : 11:32:21
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Il titolo è "The ubiquitin-editing enzyme A20 requires RNF11 to dowregulate NFKB signalling", lo trovi facilmente,è di shembade et al,2009.
La figura a cui mi riferisco è la 2A!
Graie mille fammi sapere! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2009 : 11:46:40
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Ok, adesso mi è tutto più chiaro. Semplicemente quello che vedi con lo scrambled è il livello basale di trascrizione di NFkB. Se silenzi RNF11 allora viene trascritto di più, se invece lo overesprimi viene espresso di meno.
Io personalmente avrei anche inserito la risposta di cellule non trattate, comunque direi che la spiegazione è questa!
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tkiara
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2009 : 11:58:42
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Si esatto concordo.
Invece non ho ben capito a cosa serve il controllo interno con Renillina.Inoltre i dati del saggio luciferasi su questo controllo non sono nemmeno mostrati... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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tkiara
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2009 : 15:09:18
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Mi riferisco sempre alla figura 2A, non avevo mai sentito parlare della renillina e non ho capito a cosa gli serve usarla come controllo per nf-kb TATA-luciferasi! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2009 : 16:47:42
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La Renilla luciferasi è semplicemente un altro tipo di luciferasi (presa da un polipo), differente dalla firefly luciferasi (presa dalla lucciola)
Se leggi nei Materials and Methods (che sono sempre molto importanti da leggere!) vedrai che dicono:
Citazione:
Firefly luciferase values were normalized based on the Renilla luciferase internal control values.
Quindi semplicemente, loro trasfettano anche con un plasmide con la Renilla luciferasi, sotto promotore forte (TK), non responsivo al TNF e quindi lo usano come standard interno per normalizzare i valori di fluorescenza. Questo per normalizzare possibili differenze nell'efficienza di trasfezione nei diversi gruppi. |
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tkiara
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2009 : 17:09:13
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Ti ringrazio moltissimo!ti chiedo solo un'ultima cosa poi ti lascio in pace!nella figura 3A vanno a vedere se RNF11 è implicato nella terminazione del segnale di NF-KB e quindi nella fosforilazione di di IkBa e di JNK , giusto?
Quello che non riesco ad immginare è come può centrare JNK nel pathway di segnalazione di NF-kB, nell'articolo non discutono questa cosa, o forse non l'ho letto bene io... |
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Interpretazione risultati esperimento!
Didattica
