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mikroula
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 Inserito il - 02 febbraio 2009 : 14:32:45
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Avrei bisogno di un protocollo per cloni inducibili. Qualcuno mi sa aiutare mandandone uno o indicandomi qualchelink utile. Grazie
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gilthanas
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100 Messaggi |
 Inserito il - 02 febbraio 2009 : 16:53:22
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Innanzitutto bisognerebe sapere cosa intendi per cloni inducibili...Se, come spero, intendi cloni di linee cellulari che ti permettono un'espressione finemente regolata di una proteina di interesse ce ne sono di vario tipo. Quello più classico è rappresentato dal sistema TET ON/TET OFF ossia l'espressione della tua proteina è dipendente dalla presenza o meno nel mezzo di coltura di un antibiotico tetraciclino-simile. Oppure con ecdisone...ce ne sono davvero tanti...ti passo un link per esempio, ma bisognerebbe capire bene cosa ti interessa davvero.
Clontech Tet expression system
http://www.clontech.com/products/detail.asp?product_id=157247&product_group_id=1446&product_family_id=1419&tabno=2 |
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mikroula
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11 Messaggi |
Inserito il - 03 febbraio 2009 : 09:46:24
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| Hai ragione non sono stata per niente chiara. Avevo fretta perchè ero a lavoro! Comunque ho utilizzato delle linee cellulari trasfettate stabilmente con un plasmide inducibile. Si tratta di linee umane e la trascrizione dell'inserto nel mio plasmide era indotta dal ponasterone. Mi chiedevo come vengono fatte queste cellule. Quindi l'intero protocollo dalla trasfezione stabile alla selezione dei cloni. Spero di essere stata più chiara.... |
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gilthanas
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100 Messaggi |
Inserito il - 05 febbraio 2009 : 12:25:41
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OK...ora è molto più chiaro...
Allora..non è facile riuscire a rispondere ad una domanda che richiederebbe molto più che il mio messaggio...
In genere per generare una linea cellulare che esprima stabilmente una proteina di interesse ci sono due possibilità principali... che fondamentalmente dipendono dal fatto se hai un costrutto plasmidico che contiene anche una marker di selezione in cellule superiori oppure no...oggi come oggi in commercio ce ne sono svariati che contengono già un marker di selezione ma spesso può capitare che non lo abbia.
Nel caso lo abbia, basta avere il costrutto, lo si trasfetta con uno dei metodi più efficienti sulla linea cellulare desiderata (per esempio e non peer fare pubblicità, fugene, lipofectamina, effectene, myrus...ce ne sono a bizzeffe e volendo puoi fare dei test per valutare l'efficienza di trasfezione usando magari un plasmide che esprime una proteina fluoerescente) e dopo alcuni giorni si inizia la selezione a concentrazioni via via crescenti dell'antibiotico presente nel vettore. dopo alcuni giorni le cellule resistenti (le cellule quindi che avranno integrato nel genoma il tuo costrutto) comincereanno a proliferare anche in presenza dell'antibiotico fino a formare dei cloni che poi verranno testati per la presenza del costrutto...via PCR per esempio...
nel caso il vettore in questione non abbia un marker di selezione si deve cotrasfettare il vettore di interesse con un'altro che porta la resistenza ad un antibiotico a cui le cellule superiori sono sensibili (puromicina, neomicina, zeocina etc..) e si presume che le cellule che hanno rivcevuto un plasmide (quello per cui selezioni) li abbiano ricevuti entrambi...non sei sicura al 100% ma ci sono buonissime probabilità che sia successo così...
Nel tuo caso specifico la tua proteina di interesse è indotta da ponasterone A, che è un analogo dell'ecdisone. In quel caso si devono fare più passaggi per arrivare alla generazione della linea in questione. Almeno due...una prima linea stabile che esprime il recettore del ponasterone...ed utilizzando questa prima linea cellulare la si deve successivamente ingenierizzare un aseconda volta per avere integrato stabilmente la sequenza responsiva al ponasterone che regola positivamente l'espressione del tuo gene di interesse...
ti lascio comunque un link carino forse con delle belle figure su queste linee...
http://www.stratagene.com/Newsletter/vol12_1/p1-4.htm |
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mikroula
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11 Messaggi |
Inserito il - 06 febbraio 2009 : 09:53:40
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| Ti ringrazio davvero tanto per l'esauriente risposta!!!Mi scuso ancora per la poca chiarezza iniziale! |
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